从小鼠巨噬细胞中提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增小鼠Toll样受体9(mTLR9)cDNA,构建真核表达质粒p3XFLAG-CMV-7.1-mTLR9,转染293T细胞,利用Western Blotting检测蛋白表达,并用双荧光素酶报告基因系统检测mTLR9对其介导的信号通路下游转录因子NF-κB转录活性影响.结果表明,本试验成功克隆到小鼠TLR9cDNA,构建的重组体转染细胞后表达的蛋白分子质量与预计相符,并能激活下游转录因子NF-κB的转录活性.

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)Toll样受体9基因(toll–like receptor 9,ScTLR9)的结构特性及其参与免疫应答草鱼呼肠弧病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染时的表达特性,采用RACE技术克隆Sc TLR9基因c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术比较分析ScTLR9免疫应答GCRV的表达特性。结果显示:ScTLR9的cDNA全长为3 687 bp,编码1 059个氨基酸,有17个富含亮氨酸重复序列(leucine r

为了研究团头鲂(Megalobrama amblycephala)TLR2(ma TLR2)在抗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染中的作用,本实验克隆了ma TLR2基因的c DNA全长。结果显示:ma TLR2基因c DNA的全长包括2923 bp,编码792个氨基酸。预测得到的ma TLR2的结构域包括一个信号肽、氨基端的亮氨酸重复基序(LRRs)、跨膜结构域(TM)和一个胞内的Toll/白介素(IL)-1受体区(TIR)。在嗜水气单胞菌感染后,团头鲂头肾中,TLR2的表达量

从小鼠的睾丸中克隆了GSE(gonad-specific expression gene)基因,并对该基因进行序列分析和Southern、Northern杂交分析。核苷酸序列分析表明,GSE基因的ORF长度为745 bp,编码247个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6 kDa;Southern杂交证明GSE可能是单拷贝的基因;Northern杂交显示,GSE基因在小鼠体细胞组织(心脏、肝脏、肾脏、大脑、骨骼肌和脾脏)中没有检测到其表达,在睾丸中表达量很高,在卵巢中表达量较低。从推断出的氨基酸序列表明,GSE蛋白在细胞中可能是一个不带有信号肽的可溶性蛋白。

缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国传统的四大海水养殖贝类之一，养殖过程中易受病原菌感染而造成大量死亡和经济损失。Toll样受体(Toll-like receptor， TLR)是目前研究最多的模式识别受体，在无脊椎动物的先天性免疫中发挥着重要作用。研究缢蛏TLR分子特征及其免疫功能对于预防和控制病原菌感染至关重要。本研究从缢蛏基因组序列中鉴定出42个TLR (ScTLR)基因，其中，33个编码典型的TLR蛋白，其余9个为TLR样蛋白。根据蛋白结构域特点，将典型的TLR蛋白分为2大类4个亚类，一类为多半胱氨酸簇TLR (mccTLR)，包括P型TLR (1个)和sPP型TLR (7个)；另一类为单半胱氨酸簇TLR (sccTLR)，包括sP型TLR (16个)和Ls型TLR (9个)。与其他9种软体动物TLR基因的类型和数目比较结果显示，缢蛏基因组中未发现其他软体动物中存在的V型和Twin-TIR型TLR，起源古老的mccTLR类群在软体动物中没有大规模的扩张，而起源较近的sccTLR类群却发生了大规模的扩张。荧光定量PCR分析显示，6种ScTLR在检测的7种组织中普遍表达，且在血细胞、鳃和肝胰腺组织中高表达。最后，副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)胁迫12 h和48 h的缢蛏鳃和肝胰腺转录组数据分析显示，副溶血弧菌感染前后9个TLR基因在鳃或肝胰腺中的表达量发生显著变化，6个基因(ctg118.25、ctg118.26、ctg356.25、ctg774.6、ctg681.6和ctg1513.5)在感染12 h或48 h后的鳃组织中显著差异表达，前5个基因表达量上调，仅ctg1513.5表达量下调；3个基因(ctg467.9、ctg2496.3和ctg903.17)在感染12 h或48 h后的肝胰腺中显著差异表达，其中，ctg467.9和ctg2496.3表达量下调，ctg903.17表达量上调。综上所述，本研究结果将为深入探讨不同TLR基因在缢蛏天然免疫中发挥的作用提供研究基础。

【背景】二化螟（Chilo suppressalis）是我国水稻上的重要害虫之一，味觉受体（gustatory receptor,GR）基因在昆虫取食、产卵等过程中发挥重要作用。【目的】基于组学数据鉴定并克隆二化螟GR基因序列，明确其在不同发育阶段和成虫不同组织中的表达特性，为后续深入研究二化螟GR基因的功能打下基础。【方法】结合二化螟转录组数据和其他昆虫的GR基因序列，通过多重序列比对，鉴定二化螟GR基因。利用RT-PCR方法克隆获得二化螟GR基因的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）序列，运用生物信息学分析工具对二化螟GR基因编码的氨基酸序列进行分子生物学特征、结构域等分析；基于最大似然法构建二化螟GR基因蛋白序列与其他昆虫GR基因的系统进化树；利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR）方法分析GR基因在二化螟不同发育阶段（1—6龄幼虫和雌、雄成虫）和成虫不同组织（雌、雄成虫的触角、头、翅、腹、足）中的表达模式。【结果】鉴定并克隆得到5个二化螟GR基因，分别命名为CsupGR1—5,ORF长度为1 122—1 428 bp，编码氨基酸序列长度为373—475 aa，其中CsupGR2、CsupGR4、CsupGR5具有7个跨膜结构域，CsupGR1、CsupGR3具有8个跨膜结构域。系统进化分析显示，CsupGR1、CsupGR2与黑腹果蝇DmelGR63a及小菜蛾PxylGR7、PxylGR8亲缘关系较近，属于CO_2受体家族；CsupGR3与黑腹果蝇DmelGR43a及家蚕BmorGR9、BmorGR10亲缘关系较近，属于果糖/肌醇受体家族；CsupGR4、CsupGR5与黑腹果蝇DmelGR64及家蚕BmorGR5—8亲缘关系较近，属于糖受体家族。发育期表达谱分析表明，二化螟5个GR基因在不同发育时期均有表达，其中CsupGR1、CsupGR4均在雄成虫中高表达，CsupGR2在1龄幼虫和雄成虫中表达量最高，CsupGR3在成虫中高表达，CsupGR5在4龄幼虫中表达量最高；组织表达谱分析表明，5个GR基因在雌、雄成虫的各组织均有表达，其中CsupGR1、CsupGR5在成虫头部表达量高，CsupGR2—4在成虫触角部位高表达。【结论】鉴定克隆的5个二化螟GR基因均具有昆虫味觉受体基因的典型特征，且在成虫触角或头部高表达，推测这5个基因可能与二化螟识别和适应寄主植物有关。

【目的】分析香蕉果实成熟及贮藏冷害下乙烯受体基因的表达特性,探讨热处理(38℃,3d)提高果实耐冷性与乙烯受体基因表达的关系。【方法】根据已报道的ETR基因的氨基酸保守序列设计引物,以香蕉果皮总RNA为模板,利用RT-PCR方法克隆香蕉的ETRcDNA,采用Northern杂交分析该基因的表达特征。【结果】香蕉果实在自然成熟进程中,两个基因在果皮和果肉中呈现不同的表达模式:果皮和果肉中Ma-ETR1的表达随果实成熟而逐渐减弱,而Ma-ERS3的表达仅在果实成熟后期略有增强;外源丙烯处理和38℃高温抑制果皮和果肉中Ma-ETR1的表达,却促进了Ma-ERS3的表达;低温促进果皮中Ma-ETR1和...

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了麦蛾OrCo基因全长序列,并将该基因命名为ScerOrCo。序列分析结果显示,ScerOrCo全长为1 876bp,开放阅读框长1 422bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜区。ScerOrCo基因的氨基酸序列与粘虫Mythimna separate嗅觉受体的同源性高达87%。qRT-PCR检测结果表明ScerOrCo只在麦蛾触角中特异性表达,且雌雄虫间表达量无显著差异。

为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...

应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。...

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA。序列分析表明,cDNA含443 bp5-′UTR、2496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3-′UTR。比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子。推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸。gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富。

为研究赤点石斑鱼Toll样受体(TLRs)的进化、分布及表达模式，本实验基于已公开的赤点石斑鱼基因组和转录组数据，利用Blast、系统进化与共线性等生物信息学方法，分析赤点石斑鱼TLRs基因家族的系统进化、染色体分布及在各组织中的表达模式。结果显示，在赤点石斑鱼中共鉴定出17个TLR基因，这些基因分属于5个亚家族(TLR1、TLR3、TLR5、TLR7和TLR11)，分别分布在24条染色体中的11条染色体上；17个TLR基因在赤点石斑鱼不同组织中具有不同的表达模式，然而，位于相同染色体上的TLR基因的不同拷贝则存在相似的表达模式。其中EaTLR18-1与EaTLR18-2均位于9号染色体上，二者的表达模式高度相似，均在心脏中高表达；同位于20号染色体上的EaTLR2-1a与EaTLR2-1b的表达模式也高度相似，均在脑中高表达；EaTLR5M与EaTLR5S同位于14号染色体上，二者不仅具有高度相似的LRR结构域，且在不同组织中的表达水平也高度相似；而位于18号染色体的EaTLR7与EaTLR8和位于4号染色体的EaTLR2-2与EaTLR3，其表达模式却存在明显差异。研究结果可为鱼类Toll样受体系统进化分析提供参考数据，也为进一步研究赤点石斑鱼Toll样受体基因的功能奠定基础。

本实验克隆了大菱鲆趋化因子受体基因CCR3和CCR9的全长cDNA,并进行了鉴定。其中,全长cDNA的克隆采用了5′和3′-RACE。CCR3 cDNA全长1 451 bp,包括92 bp的5′非编码区,276 bp的3′非编码区以及编码360个氨基酸的1 083 bp的开放阅读框。CCR9 cDNA全长1 441 bp,包括59 bp的5′非编码区,278 bp的3′非编码区,以及编码367个氨基酸的1 104 bp的开放阅读框。两种受体均具有7次跨膜结构,符合G蛋白偶联受体的序列特征。系统进化分析表明,大菱鲆CCR3与其他鱼类CCR3聚为一支,大菱鲆CCR9也与其他鱼类的CCR9聚为一支;...

【目的】克隆并分析高原牦牛Toll样受体1基因(TLR1)的特点。【方法】提取麦洼牦牛脾脏RNA,反转录合成cDNA,以其为模板分段扩增后拼接获得麦洼牦牛TLR1基因编码区序列,采用相关分析软件对基因进行序列分析,并对其编码的蛋白质进行基本理化性质分析及预测。【结果】分段扩增获得了TLR1基因1 484bp的上游序列和823bp的下游序列,拼接后获得2 287bp的cDNA序列。TLR1基因系统进化树及同源性比对结果表明,TLR1基因极其保守,牦牛TLR1基因与黄牛、绵羊等哺乳动物遗传距离很近。预测TLR1基因含有1个2 184bp的开放阅读框,编码727个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为83....

提取罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)上海养殖群体活体鳃、肌肉、肝胰腺、血液和雄性腺5种组织的总RNA;应用RT-PCR技术,从鳃组织中克隆到Toll样受体(TLR)基因部分cDNA序列,并进行生物信息学分析。基因序列分析表明:所得罗氏沼虾TLR基因cDNA序列长1 875 bp,包含1 728 bp的开放阅读框,可编码575个氨基酸残基;该部分TLR是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRR-CT、LRR-NT结构域及关键的胞内区TIR结构域,具备Toll样受体家族的典型结构特征;TIR结构域与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和日本囊对虾(Ma...