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[期刊] 西南农业学报
[作者]
梁庆龙 浩洪龙 牟瑞营 王林峰 葛利江
用rcPL对6~8周龄的昆明小鼠进行免疫注射制备多抗,第3次加强免疫后第6天采集少许血清,用琼脂凝胶免疫扩散(AG ID)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体的产生情况;分娩后立即通过剖腹产的方法获得山羊胎盘组织,用获得的抗血清通过免疫组织化学(IHC)和间接荧光抗体试验(IFA)的方法定位胎盘催乳素。结果表明,琼脂扩散检测抗原浓度为100μg/mL,用ELISA中酶标仪检测450 nm处OD值,免疫血清与阴性对照的比值P/N为7.77;IHC和IFA显示胎盘催乳素在肉阜和子叶的双核细胞及单核细胞中表达。使用背部皮下多点注射的方法对昆明小白鼠进行免疫来制备重组山羊胎盘催乳素多克隆抗体是...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王炳祥 顾国生 李鑫雨 葛利江
本文分离并初步鉴定山羊胎盘小肽,探讨各小肽对小鼠抗氧化能力的影响。采用超滤法制得山羊胎盘小肽的粗提物(Mr≤10 kDa),经Superdex-75层析分离,Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳初步鉴定,分离的各种小肽及粗提物按低中高剂量分别腹腔注射小鼠,每天1次持续1周,测小鼠血清中SOD和MDA的含量。结果表明:Superdex-75层析得到4个组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,电泳显示其分子量分别为10.139、8.166、7.447、6.761 KDa,试验小鼠血清检测显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的SOD和MDA含量与对照组没有显著差异(P(0.05),Ⅳ和粗提物能提高SOD含量和降低MDA含量,不过低剂...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘平 张昀 郑喜邦 李恭贺 岑小妹 岳磊磊 宗自杰 卢晟盛 卢克焕 张明
【目的】构建山羊Sox2原核表达载体—pRSET-Sox2,并将诱导表达、纯化的His-Sox2融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备Sox2多克隆抗体。【方法】从pMD18T-Sox2载体上以Bam H I和Xho I双酶切截取Sox2片段,然后将其亚克隆到pRSET-A表达载体上,获得pRSET-Sox2重组质粒。转化了pRSET-Sox2的大肠杆菌BL21(DE3),1 mmol.L-1 IPTG 37℃诱导4 h,SDS-PAGE电泳及Western blotting检测融合蛋白表达。相同条件下大量增菌诱导,用Ni-NTA argrose介质分离纯化His-Sox2重组蛋白。将体外复性的融合蛋...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
邢光东 杨廷桂 段修军 宦海琳 闫俊书 王根林
为深入研究鹅催乳素受体(PRLR)的功能,构建了含鹅PRLR胞外域编码序列exPRLR的原核表达质粒exPRLR-pET-28a(+),通过转化E.coli Roster建立了稳定的原核表达系统,在IPTG诱导下获得了PRLR胞外域的重组exPRLR。以重组exPRLR为抗原免疫家兔,获得了兔抗鹅exPRLR的抗血清。Western blot分析证明该抗血清可特异识别由原核生物表达的重组exPRLR。进一步分析成年母鹅的组织蛋白,发现成年鹅中可能至少存在3种相对分子质量不同的PRLR蛋白异形体。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马跃 王建珏 黄江涛 张天颖 史怀平
【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导
[期刊] 中国农业科学
[作者]
朱才业 韦光辉 李伟 王丹 郑蒙蒙 刘志永 张亚妮 李碧春
【目的】克隆徐淮山羊硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD1)基因的cDNA并分析该基因生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白在亚细胞水平定位该基因表达产物,研究该基因在异种动物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性及外源基因能否稳定遗传。【方法】采用RT-PCR方法从徐淮山羊脂肪组织中克隆SCD1基因cDNA,进行生物信息学分析,并构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-SCD1,脂质体(LTX)介导基因转染NHI-3T3细胞,48 h后荧光倒置显微镜下观察基因表达产物的分布,RT-PCR检测mRNA在体外水平的表达。利用睾丸注射法制备转基因小鼠,在F1代和F...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王学斌 俞慧清 吴晓东 徐旭俊 陈建泉 成国祥
【目的】利用朊蛋白双基因敲除(PRNP-/-)羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白(PrP)原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并对获得的朊蛋白多克隆抗体进行ELISA及Western-blot检测。【结果】获得了大量的朊蛋白特异性抗血清,间接ELASA检测抗血清中朊蛋白多克隆抗体的效价为25600;Western-blot检测显示所制备抗体不仅可以识别鼠、牛、羊脑组织内源性朊蛋白,而且能识别鼠脑组织内朊病毒。【结论】PRNP-/-转基因山羊可用于制备大量高亲和力朊蛋白多克隆抗...
[期刊] 水产学报
[作者]
王培 王蓓 鲁义善 蔡佳 汤菊芬 吴灶和 简纪常
为研究sIgM在吉富罗非鱼体内的组织分布及其在亚细胞水平上的定位,本实验利用纯化的SIGM融合蛋白,按照常规方法免疫新西兰大白兔,制备了兔抗吉富罗非鱼SIGM多克隆抗体;并对吉富罗非鱼肠、脾脏及鳃组织进行了免疫组织化学分析以及胶体金免疫电镜分析。结果显示,ELISA检测所获得的抗血清效价为1∶256 000,该血清能与SIGM融合蛋白发生特异性免疫反应。在肠和鳃组织中,阳性信号存在于富含黏液细胞的上皮细胞层表面,在杯状细胞和黏液细胞中则不存在;在脾脏组织中,阳性信号存在于特定的细胞中。免疫电镜结果显示SIGM主要存在于肠上皮细胞膜附近,并且在肠组织上皮细胞膜表面的微绒毛处含量较多;在鳃上皮组织...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋志成 费新敏 杨煜 乔利仙 王晶珊 李广存 郭宝太
利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张婷婷 周光现 王昕 张智英
【目的】探索快速制备高品质X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)多克隆抗体的方法,为研究XIAP基因的功能及XIAP蛋白在肿瘤组织中的表达量检测提供参考。【方法】通过RT-PCR方法获得人XIAP基因的CDs区序列,与pET151/D-TOPO载体连接,构建XIAP基因的原核表达载体;考察细胞密度(OD600)、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对XIAP重组蛋白表达量的影响,以确定XIAP重组蛋白的最佳诱导条件,并用Ni-NTA亲和层析柱法纯化XIAP重组蛋白;用纯化的XIAP重组蛋白对2只成年新西兰白兔进行常规免疫后,再对其中1只进行耳静脉注射加强免疫,连续3d,每天免疫1次,用ELISA检测抗体效...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
谭鹏 徐曼 梁航华 张亚军 胡仁建 崔红娟
【目的】克隆家蚕（ＢｏｍＢｙｘ ｍｏｒｉ）ＧＡＴＡ转录因子ＢｍＧＡＴＡ６，将其在原核细胞中进行表达，纯化重组蛋白，多次免疫小鼠获得ＢｍＧＡＴＡ６多克隆抗体，为进一步分析ＢｍＧＡＴＡ６在家蚕变态发育中的功能提供抗体条件。【方法】解剖家蚕获得５龄第３天的各组织及４眠至熟蚕整个时期的中肠组织，在液氮中研磨为粉末，利用Ｔｒｉｚｏｌ法提取ｒＮＡ，体外反转录得到ｃ ＤＮＡ。基于家蚕ＢｍＧＡＴＡ６的基因编码序列设计全长特异引物，并以Ｂｍ ＡｃＴｉＮ３作为内参，进行家蚕５龄第３天各组织及４龄眠期至熟蚕期各时期的ｒＴ－Ｐｃｒ检测。设计原核表达引物，扩增原核表达片段连接到Ｐ ＥＴ３２Ａ载体上，构建原核表达载体，转．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张明烽 唐爽 宋红卫 张涌
根据GeneBank(U37518)中TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)的cDNA序列,设计扩增引物。采用RT-PCR从人胎盘中扩增出TRAIL基因的全长cDNA。产物纯化后连至pGEM-TEasy载体,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆菌,酶切鉴定并进行序列测定。结果表明,本试验成功地克隆了TRAIL基因的1039bp全长cDNA。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李芳 罗军 许会芬 石恒波 朱江江
【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨光 霍雨佳 苏红 智达夫 刘默凝 窦傲蕾 王家业 曹贵方
[目的]克隆草原短尾羊Brachyury基因(即T基因)编码区(CDS),并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。[方法]提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brach yury基因CDS全长序列连接至pEASY~?-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY~?-Blunt E1-Brach yury,并进行NheⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB(DE3)大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA(iELISA)法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。[结果]克隆了1335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY~?-Blunt El-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。[结论]成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。
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