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[期刊] 中国农业科学
[作者]
卫晓彬 王亚楠 张超 单丽伟 唐如春 范三红
【目的】克隆普通小麦胚乳特异表达转录因子基因WPBF,对其原核表达条件进行优化,并验证其编码蛋白和小麦高分子量谷蛋白亚基基因(HMW-GS)上游Prolamin-Like box的结合特性,为小麦HMW-GS表达调控机制的阐明奠定基础。【方法】利用RT-PCR扩增得到WPBF编码区,将其连接到pET-21a-MBP载体中,并分别在E.coliT7 Express和Origami B(DE3)菌株中诱导表达。依次利用Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,最后通过凝胶迁移阻滞试验(EMSA)对重组蛋白的DNA结合特性进行分析。【结果】在33℃的Origami B(DE3)菌株中表达含...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
成建红 白松龄 韩振海 许雪峰 李天忠
目的克隆李属甜樱桃自交不亲和性花粉S-决定子基因,为今后果树配子体自交不亲和性机理研究奠定理论基础。方法根据GenBank登录的16个S-locusF-box同源基因保守区设计兼并引物,利用RT-PCR、RACE等手段,从甜樱桃品种红灯花粉cDNA中克隆到两个编码376-氨基酸多肽的全长基因。结果GenBankBlast分析显示,克隆的两个基因中一个基因编码的蛋白产物与数据库甜樱桃自交不亲和性S3-单元型特异的PaSFB3(AB096857)编码的氨基酸序列完全一致。另一个基因编码一新的PaSFB同源序列,其推测的氨基酸序列N-端同SFB3一样具有明显的F-box基序,与PaSFB1～6的一致...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵云祥 徐兆师 陈明 李连城 陈耀锋 邱志刚 熊祥进 马有志
【目的】构建ERF(ethylene-responsive element binding factor)转录因子基因W17的亚细胞定位载体和原核表达载体,验证W17是否具有核定位功能,阐明W17与GCC、DRE探针的体外结合特性,利用GUS瞬时表达系统分析W17蛋白的体内结合特性和转录激活功能,初步预测W17在植物胁迫信号传导途径中的作用。【方法】构建W17/163hGFP亚细胞定位载体,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24h后共聚焦显微镜下观察。构建W17/pGEX-4T-1原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG(0.5mmol·L-1,3h)诱导,GST纯化柱纯化,纯化的融...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
石径 周亚迪 罗永康 江米足
研究牛乳蛋白过敏儿童血清中对4种主要乳蛋白过敏原的抗体特异性情况。采用间接酶联免疫吸附法测定乳过敏儿童血清中4种乳蛋白过敏原特异性IgE抗体。结果显示,乳过敏儿童血清中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特异性IgE比例较高,特异性IgE阳性率分别可达44.3%和39.3%,其次α-酪蛋白和β-酪蛋白特异性IgE阳性率为31.2%和36.1%。研究结果表明,乳过敏儿童对4种乳蛋白过敏原都有一定比例的特异性IgE抗体,其中α-LA和β-LG的阳性率较高,是乳蛋白过敏儿童的主要过敏原蛋白,大部分乳过敏儿童不止对1种乳
关键词：
牛乳蛋白 过敏儿童 特异性IgE 过敏原
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张帅 张永军 苏宏华 高希武 郭予元
【目的】克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白。【方法】以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT-PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1表达载体在BL21(DE3)系统中进行原核表达,使用GSTrapFF预装柱进行纯化并切去标签。【结果】克隆了命名为HarmPBP2(GenBank登录号:EU647241)的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457bp,编码149个氨基酸残...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈琳 魏纪珍 刘臣 牛琳琳 张彩虹 梁革梅
【目的】研究棉铃虫(Helicoverpa armigera)中肠蛋白ABCC1(HaABCC1)与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系(96S)和Cry1Ac抗性品系(BtR)棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系(BtR)与敏感品系(96S)棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孟凡荣 李永春 凌娜 王潇 司志飞 张艳霞 尹钧
【目的】分析小麦甲基结合蛋白基因TaMBD1和TaMBD6的序列特征及其在种子形成和萌发过程中的表达模式,为探讨小麦种子形成及萌发过程中的表观遗传学调控机制积累资料。【方法】利用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并通过半定量RT-PCR分析克隆基因在小麦种子不同发育阶段及萌发过程中的表达模式。【结果】获得了小麦甲基结合蛋白基因TaMBD1和TaMBD6的cDNA全长,可分别编码193和187个氨基酸。氨基酸序列分析发现,TaMBD1和TaMBD6均包含有典型的甲基结合域,TaMBD1还包含1个CW型的锌指结构域。三维结构分析显示,TaMBD1和Ta...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨芳 贺鹏 董双林
信息素结合蛋白(PBP)是大量存在于昆虫触角感器中的一类小分子蛋白,它特异性结合并运输性信息素组分到神经树突膜上的气味受体。通过设计简并引物并利用RT-PCR技术,从斜纹夜蛾雄虫触角扩增到1个长171bp的预期cDNA片段,测序后经比对表明是PBP3基因片段,将该基因命名为SlitPBP3。利用RACE技术进一步得到SlitPBP3的cDNA全长序列(GenBank登录号:GU082321),长568bp,编码164个氨基酸,具有PBP的典型序列特征。对基因组DNA的研究显示,该基因由3个外显子和2个内含子构成。2个内含子的位置和斜纹夜蛾的另2个PBP基因相同,具有保守性;其长度分别为124b...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
国凤利 王凡玲 孟繁静
玉米赤霉烯酮是植物体内源产生的一类小分子生理活性物质，已证明它与冬性植物的春化作用密切相关。本研究应用亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对春化的冬小麦幼苗中的玉米赤霉烯酮结合蛋白进行了分离纯化。供试材料为冬小麦品种燕大1817，种子前发后在4℃下春化4周，提取幼苗的水溶性总蛋白进行亲和层析。层析基质为琼脂糖凝胶Sepharose4B，配体为玉米赤霉烯酮多聚赖氨酸复合物。总蛋白溶液先经过Sepharose4B结合后，再与连有配体的亲和胶进行反应，然后洗去非结合蛋白；改变洗脱条件，进一步洗涤得到的为玉米赤霉烯酮结合蛋白（ZBP）溶液。研究结果表明，在春化的冬小麦幼苗中存在两种玉米赤霉烯酮结...
关键词：
玉米赤霉烯酮 结合蛋白 亲和层析 冬小麦
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
韩玉珍 孟繁静
采用放射配体结合分析法结合生化技术分析了冬小麦春化期间的玉米赤霉烯酮（ZEN）特异结合蛋白。表明在冬小麦幼苗中存在着ZEN的特异结合蛋白（ZBP）。ZBP对ZEN的结合具有可饱和的性质，Scatchard分析表明解离常数Kd=1．9×10-7mol．L－1，结合位点数目n=6．2mol．mg－1可溶性蛋白。30％饱和硫酸铵沉淀可使ZBP纯化3～4倍。对ZBP进行的聚丙烯酸胺凝胶电泳分析表明3H－ZEN结合到两个组分上，特异结合组分可能在Rm0．5处。
关键词：
玉米赤霉烯酮 结合蛋白 冬小麦
[期刊] 中国农业科学
[作者]
高坤 邓祥元 朱峰 汪生鹏 钱荷英 郭锡杰
【目的】从体外表达家蚕中新发现的1个免疫球蛋白超家族成员—类胰岛素相关肽结合蛋白2(BmIBP2),并制备其多克隆抗体,为进一步深入研究BmIBP2的生物学功能奠定基础。【方法】以家蚕中肠的总cDNA为模板,利用普通PCR方法,扩增出BmIBP2基因的成熟肽序列;通过构建重组表达质粒pET-28a-BmIBP2对BmIBP2的成熟肽进行重组表达;制备多克隆抗体,通过免疫共沉淀的方法研究BmIBP2蛋白的组织特异性。【结果】SDS-PAGE电泳分析表达产物发现,重组蛋白rBmIBP2主要以包涵体的形式表达,目的蛋白大小约为30 kD;以兔抗His-tag抗体为一抗进行Western blot检测...
[期刊] 水产学报
[作者]
邱高峰 陈洁
Dmrt是性别调控因子Doublesex和Mab-3的相关基因,近年报道了中华绒螯蟹EsDmrt-like只在精巢中表达,为了验证EsDMRT-like蛋白是否在中华绒螯蟹精巢中特异表达及其功能,根据中华绒螯蟹EsDmrt-like基因序列,构建重组质粒pET-32a-EsDmrt-like,转化大肠杆菌BL21,经融合表达和SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为46ku。利用Ni柱亲和纯化融合蛋白免疫家兔,制备获得EsDMRT-like多克隆抗体。Western-blotting检测表明该抗体既能特异地识别重组蛋白,又能特异识别精巢中EsDMRT-like蛋白,并...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
朱圣杰 崔阔澍 白松林 张鹏飞 郝水源 郝雅娴 陈龙
【目的】探究AcinJHBP基因在春尺蠖生长发育与滞育中的作用。【方法】基于前期所测春尺蠖蛹转录组数据（非滞育蛹-滞育蛹与滞育蛹-滞育解除蛹），克隆获取JHBP基因，命名为AcinJHBP（GenBank登录号: OR860357）；利用生物信息学软件分析AcinJHBP基因的序列特征及理化性质；采用qPCR技术检测AcinJHBP的时空表达（不同发育阶段和组织）情况。【结果】春尺蠖AcinJHBP基因完整CDS序列全长726 bp，编码241个氨基酸，蛋白质预测分子量为26.97 kDa，预测等电点为5.13。春尺蠖AcinJHBP基因预测分子式为C_(1211)H_(1915)N_(313)O_(364)S_(9)，负电荷残基(Asp + Glu)总电荷为34，正电荷残基（Arg + Lys）总电荷为26，半衰期和脂肪指数分别为30 h和97.51。该蛋白的平均亲水性为-0.098，预测不稳定系数为27.13，故该蛋白属于亲水稳定蛋白，N端氨基酸为蛋氨酸（Met， M）。AcinJHBP在N端含一个长为17个氨基酸残基的信号肽，但无跨膜区；磷酸位点检测分别发现丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸位点分别为9、6和3个，未发现糖基化位点。亚细胞定位结果显示，其主要位于细胞外。系统进化结果表明，AcinJHBP与同为鳞翅目尺蛾科的冬尺蠖（Operophtera brumata）血淋巴保幼激素结合蛋白JHBP亲缘关系最近。基因表达结果显示，在不同发育阶段，AcinJHBP基因在春尺蠖卵～5龄幼虫期间表达均较低（3龄幼虫除外），且无显著差异（P＞0.05），而在非滞育蛹-成虫期，AcinJHBP表达量呈逐渐下降趋势。在不同组织中，春尺蠖AcinJHBP基因在雄虫头部表达量最高。【结论】AcinJHBP基因与春尺蠖生长发育与滞育密切相关，该结果为进一步揭示该基因在春尺蠖蛹越夏、越冬滞育中的功能奠定了一定理论基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
闫祺 陈严 刘晓龙 李柏桦 廖辉 张小晴 董双林
[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫双委夜蛾(Athetis dissimilis Hampson)的信息素结合蛋白(pheromone binding protein,PBP)基因,并分析其序列和组织表达特征,为进一步研究双委夜蛾的嗅觉感受机制奠定基础。[方法]基于双委夜蛾触角转录组数据获得3个PBP基因(Adis PBP1、Adis PBP2、Adis PBP3)的全长序列,通过RT-PCR对3个基因进行克隆和验证,利用RT-qPCR对3个基因在雌、雄成虫的组织表达谱进行分析。[结果]从双委夜蛾触角中克隆3个PBP基因的c DNA序列,3个基因Adis PBP1、Adis PBP2及Adis PBP3分别编码166、169和164个氨基酸,并具有6个保守的半胱氨酸、N端1个信号肽序列等该类基因的典型特征。聚类分析表明:这3个基因分别被聚到3个不同的PBP分支中,且均与同属害虫二点委夜蛾(Athetis lepigone)的相应PBP最近。表达谱分析显示:3个基因均仅在雌、雄虫触角中高表达; Adis PBP1在雄性触角的表达量显著高于雌性触角,而Adis PBP2和Adis PBP3在两性触角中的表达量相似; 3个基因雄、雌蛾触角的表达量差异(雄∶雌)分别为1.84、1.14和0.95,暗示其在性信息素及其他气味感受中的不同作用。[结论]克隆了双委夜蛾3个PBP基因的c DNA全长序列,明确了3个基因的组织表达谱及雌、雄表达差异,对3个PBP基因的可能功能进行了讨论。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
金俊彦 张亚楠 杨科 高建清 董双林
针对重要农业害虫大螟,通过序列相似性分析从转录组数据获得2个普通气味结合蛋白(general odorant-binding protein,GOBP)基因cDNA片段,利用RACE技术进一步得到cDNA全长,分别命名为SinfGOBP1和SinfGOBP2。2个基因编码的氨基酸序列和已报道的昆虫同源序列具有较高的相似性,其中SinfGOBP1和黄地老虎、小地老虎的相似性最高,分别为91%和90%;SinfGOBP2和谷实夜蛾、甘蓝夜蛾的相似性最高,均为87%。进化分析表明,不同昆虫GOBP被明显分为GOBP1和GOBP2两个亚组,暗示2个亚组GOBP在功能上的分化;此外,相同亚组内GOBP基...
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