【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转...

【目的】锌指类转录因子在植物逆境信号转导和非生物胁迫响应中发挥重要的作用。通过对小麦锌指转录因子基因Ta Di19A的耐冷性能进行鉴定,利用酵母双杂交技术筛选并获得与Ta Di19A互作的候选蛋白,以解析Ta Di19A介导的抗逆调控机制。【方法】通过对低温处理的小麦转录组测序结果进行分析,获得一个锌指类转录因子Ta Di19A。利用生物信息学的方法分析Ta Di19A的分子特性,用SMART在线工具进行蛋白结构分析;用GSDS和PHYRE2在线工具分别对Ta Di19A结构和蛋白三级结构进行分析;用Ne

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子At MYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明At MYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子At MYB73的酵母诱饵表达载体p AS1-At MYB73,检测p AS1-At MYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆At MYB73的N端区域(含有R2R3结构域)和C端区域(不含R2R3结构域),检测At MYB73的N端和C端的转录激活活性,分析At MYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以At MYB73为诱饵筛选拟南芥的c DNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选...

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3—5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2...

【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基

【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白(Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973)可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白，深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作；最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×10~6和3.2×10~6 CFU·mL~(-1),平均插入片段大小在1 200 bp以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白，其中有2个MADS-box转录因子，3个E3泛素连接酶，2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达，而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白，并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1之间存在明显的互作关系。

[目的]揭示小麦蓝矮植原体(WBD phytoplasma)的致病机理及其与寄主的互作关系,为植原体病害防治提供理论依据。[方法]以SWP16为诱饵,将SWP16构建到诱饵载体pBT3-STE和pBT3-SUC上,在小麦酵母双杂交膜系统cDNA文库中筛选与SWP16互作的蛋白,并确定最佳的筛库条件。通过α-半乳糖苷酶活性检测试验对筛选到的互作蛋白进行二次验证,并运用Uniprot对其进行Gene Ontology(GO)注释分析。[结果]以pBT3STESWP16作为筛库的诱饵蛋白,确定20 mmol/L 3-AT为筛选文库的最佳浓度,从小麦cDNA文库中筛选到20种互作蛋白,包括Rieske蛋白、细胞色素b5、CASP蛋白等。经过复筛和α-半乳糖苷酶活性检测试验进一步验证了互作关系,其中14种互作蛋白参与运输、pH调节、光合作用、内质网应激反应、蛋白质泛素化等生理过程;18种互作蛋白存在于线粒体、内质网、细胞膜、细胞质、叶绿体和细胞壁等6种细胞组分中;20种互作蛋白的分子功能主要包括几丁质酶活性、反转运蛋白活性、脱水酶活性、转移酶活性和转录因子活性等。[结论]筛选获得20种与小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP16互作的蛋白,有助于推动小麦蓝矮植原体与寄主互作关系的研究。

CCHC型锌指结构蛋白Os ZFP参与调控水稻Oryza sativa侧根的生长发育,但其相关互作蛋白及调控机制未知。以水稻‘日本晴’‘Nipponbare’为试验材料,克隆了Os ZFP基因,利用Eco RI和Sal I酶切位点构建酵母双杂交钓饵表达载体p GBKT7+Os ZFP,验证该表达载体对酵母菌株Y2H无毒性及报告基因自激活现象;采用酵母双杂交技术,从已构建的水稻c DNA文库中筛选到1个阳性互作蛋白,经美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)同源性比对,鉴定为含有T-complex pol

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP(basic-leucine zipper)转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过...

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统(split-ubiquitin yeast membrane system),以小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)的外壳蛋白(CP)基因为诱饵对异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)c DNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds c DNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到p PR3-N文库载体上,构建得到以p PR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统c DNA文库。同时,构建带有S...

【目的】草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)是侵染草莓的主要病毒,但其侵染草莓的机制尚不清楚。论文以SVBV的P6蛋白为诱饵筛选森林草莓(Fragaria vesca)c DNA文库的寄主因子,为解析SVBV侵染草莓的分子机制提供理论依据。【方法】SVBV接种森林草莓,提取出现明显症状叶片的总RNA,Dnase I处理后,用SMART法反转录合成ds c DNA,均一化处理c DNA并酶切纯化,将1 kb,表明森林草莓c DNA文库符合试验标准。最终利用SD

茉莉花JsMYB108转录因子可以调控茉莉萜类合成酶基因JsTPS2的表达，是香气合成相关的转录因子.本试验将茉莉JsMYB108转录因子的编码序列利用酶切连接方法构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，转化大肠杆菌BL21(DE3)株系，设定了4个IPTG诱导浓度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol·L~(-1))和3个诱导温度(20、28、37℃)用于筛选合适的蛋白诱导条件，在此基础上对诱导出来的蛋白进行分离纯化和检测.结果表明：4个IPTG浓度均可成功诱导出分子质量约为59 ku的融合蛋白，不同IPTG浓度间诱导表达的蛋白量无显著差异；20、28、37℃均可诱导出融合蛋白，但相比28、37℃的诱导温度，20℃过夜诱导表达下的可溶性蛋白含量最高，更有利于重组蛋白的纯化.后续用0.1 mmol·L~(-1) IPTG、20℃作为大量诱导JsMYB108融合蛋白的条件，利用GST亲和树脂分离纯化了融合蛋白，并通过Western blotting对纯化的蛋白进行了验证.研究结果可为后期筛选JsMYB108互作蛋白及其蛋白功能的研究提供参考.

为探究转录因子TaMADS2在小麦抗叶锈病中的功能，以TaMADS2基因在亲和/非亲和小麦与叶锈菌互作过程中上调表达，且在非亲和组合中上调表达时期较亲和组合更早为依据，利用BSMV-VIGS技术沉默‘中国春’‘郑麦9023’中TaMADS2基因表达，观察TaMADS2沉默植株的表型以及病程相关基因的转录水平变化。结果表明：在接种叶锈菌后，TaMADS2基因沉默植株较对照相比叶锈菌感染加重，单侵染点处活性氧积累面积减小，菌丝长度增加，发病面积增大，促进了病原菌的生长，减弱了植物的抗性反应；通过qRT-PCR分析发现在叶锈菌侵染早期，病程相关基因TaPR1和TaPR2的表达水平下调。综上，TaMADS2基因可能通过调控抗病相关基因的表达正向调控小麦对叶锈菌的抗性。