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[期刊] 华北农学报
[作者]
许媛 李铃仙 魏春茹 魏新燕 于秀梅 刘大群
ＳＫＰ２Ａ是调控细胞周期转录因子降解的Ｆ－ｂｏｘ蛋白。为研究该蛋白在小麦－叶锈菌互作过程的作用，首先克隆获得中国春小麦ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ全长序列，然后将其与ＰＧｂＫＴ７载体连接，转入酵母Ｙ１８７感受态细胞中，构建酵母诱饵表达载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明，ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ编码区序列长度为１ １４６ ｂＰ，其ｏＲＦ区编码一条由３８２个氨基酸组成的多肽。在ｏＲＦ区两侧连接酶切位点（ＥｃｏＲⅠ和ｂＡｍ ＨⅠ），并将其与载体ＰＧｂＫＴ７连接，成功构建了包含目的基因的诱饵载体ＰＧｂＫＴ７－ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ，且含重组诱饵质粒的酵母菌株在ＳＤ／－ＴＲＰ营养缺陷平板上生长良好，其．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡湘云 高小龙 付向晶 王燕平 刘丹丹 常旭东 刘蓬 杜恩岐 王兴龙 党如意 杨增岐
【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素－神经氨酸酶（ＨＮ）蛋白线性中和表位区的诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ，为筛选靶向新城疫病毒ＨＮ蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成ＨＮ蛋白的线性中和表位区ＨＮ－Ｎｅｕ，将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体ｐＧＢＫＴ７中，构建诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ，经酶切鉴定和测序验证正确后，将ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ转化酵母菌Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ，检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了ＨＮ－Ｎｅｕ，构建的ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ在酵母细胞Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅ．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭敏 苏绍萍 陈秀荔 杨春玲 朱威霖 王建平 曾地刚 李咏梅 赵永贞 陈晓汉
应用酵母双杂交体系，构建凡纳滨对虾ＩＨＨＮＶ ３个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体，并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测，为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾ＩＨＨＮＶ病毒３个开放阅读框的基因片段进行ＰＣＲ特异性扩增，并运用ＩＮ－ＦｕｓＩｏＮ技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒ＰＧＢＫＴ７进行连接，获得重组质粒ＰＧＢＫＴ７－ＣＰ、ＰＧＢＫＴ７－Ｎｓ１和ＰＧＢＫＴ７－Ｎｓ２，并进行自激活和毒性检测。结果表明，ＰＧＢＫＴ７－ＣＰ、ＰＧＢＫＴ７－Ｎｓ１和ＰＧＢＫＴ７－Ｎｓ２等３个重组质粒对ＭＥＬ１报告基因无自激活性；对ＡｕＲ１－Ｃ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
翟玉山 彭磊 杨永庆 邓宇晴 程光远 郑艳茹 徐景升
为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制，利用酵母双杂交技术筛选与ＳＣＳＭＶ互作的甘蔗因子基因，利用ＰＣＲ技术克隆了ＳＣＳＭＶ的ＨＣ－ＰＲｏ、Ｐ３Ｎ－ＰＩＰｏ、ＣＰ和ＶＰｇ的编码区，构建到酵母双杂交诱饵载体Ｐ ｇＢＫＴ７上，获得了Ｐ ｇＢＫＴ７－ＨＣ－ＰＲｏ、Ｐ ｇＢＫＴ７－Ｐ３Ｎ－ＰＩＰｏ、Ｐ ｇＢＫＴ７－ＣＰ和Ｐ ｇＢＫＴ７－ＶＰｇ ４个诱饵载体。结果显示，将重组质粒转化酵母Ｙ２Ｈｇｏｌｄ酵母菌株后，酵母菌株在Ｓｄ／－ＴＲＰ平板上生长良好，表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性；在Ｓｄ／－ＴＲＰ／Ｘ－α－ｇａｌ平板上长出白色菌落未变蓝，在Ｓｄ／－ｌｅｕ、Ｓｄ／－ＴＲＰ／－ａｄｅ、Ｓｄ／－Ｔ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李谋 王春丽 刘小林 张成岗
以人胎儿脑cDNA文库为模板克隆了钠钾泵β2亚基C末端编码区(N KAβ2ct),构建了表达载体pGBKT 7-NKAβ2ct,并对其进行了表达,对表达产物进行了检测。结果表明,N KAβ2ct长690 bp,pGBKT 7-NKAβ2ct酵母表达载体构建成功,在酵母中表达良好,可用于后续的酵母双杂交文库筛选工作。
关键词：
钠钾泵β2亚基 载体构建 酵母表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
康静敏 刘坤 刘严 张怡 李成伟 谭光轩
为了分离克隆与植物互作的大丽轮枝菌致病相关蛋白基因,利用SMART技术构建了大丽轮枝菌酵母双杂交c DNA文库。结果表明,构建的文库滴度为5.2×107cfu/m L,库容为3.9×107cfu;文库c DNA插入片段长度主要分布在0.5~2.0 kb,平均为1 kb;文库重组率为96%。表明文库质量较好,为筛选与植物互作的大丽轮枝菌致病蛋白基因奠定了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张恒 陈怡名 张旭 牛影 赵佳 吴承云 郝永利 孙丽 王海燕 肖进 王秀娥
[目的]本文旨在使用“Mate＆Plate”技术构建簇毛麦受白粉菌诱导的酵母双杂交文库，鉴定正向调节小麦白粉病抗性的簇毛麦E3泛素连接酶蛋白CMPG1-V的互作蛋白，为解析其抗病性机制奠定基础。[方法]提取白粉菌诱导前及诱导后1、2、4、6、12、24和48 h的簇毛麦叶片总RNA，利用SMART技术分离纯化mRNA，合成ds cDNA，将ds cDNA和pGADT7-Rec载体共同转入酵母菌株Y187，构建簇毛麦酵母双杂交文库，明确文库插入片段大小和滴度。以CMPG1-V为诱饵筛库，并对部分互作蛋白进行了回补验证，利用BiFC方法验证CMPG1-V与筛选到的一个互作蛋白CMIN6（MYB25-V）的体内互作。[结果]成功构建了受白粉菌诱导的簇毛麦叶片酵母双杂交文库，文库滴度为9.5×10~(7 )CFU·mL~(-1)，插入片段长度在250～2 000 bp之间，重组率为100%。以CMPG1-V为诱饵筛选文库，获得79个互作蛋白，挑选其中10个互作蛋白进行回补验证。通过BiFC实验验证了CMPG1-V与MYB25-V的体内互作。MYB25-V及其在小麦中的同源基因TaMYB25受白粉菌诱导后均上调表达，推测MYB25-V可能参与调控小麦白粉病抗性。[结论]本研究成功构建了白粉菌诱导的簇毛麦酵母双杂交文库，为鉴定CMPG1-V的互作蛋白并解析其抗病性机制奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵艺泽 刘艳 王锡锋
【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统(split-ubiquitin yeast membrane system),以小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)的外壳蛋白(CP)基因为诱饵对异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)c DNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds c DNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到p PR3-N文库载体上,构建得到以p PR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统c DNA文库。同时,构建带有S...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王川 盛鸥 窦同心 李斌 胡春华 杨乔松 邓贵明 董涛 李春雨 易干军 毕方铖
[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白，深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作；最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×10~6和3.2×10~6 CFU·mL~(-1),平均插入片段大小在1 200 bp以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白，其中有2个MADS-box转录因子，3个E3泛素连接酶，2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达，而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白，并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1之间存在明显的互作关系。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨倩 包涛涛 鲜思美 张友 梁倩 顾庆林
为筛选与羊口疮病毒(OrfV)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，构建了羔羊睾丸(LT)细胞酵母双杂交cDNA文库.采用Trizol法提取LT细胞总RNA,运用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,再经同源重组法将pGADT7-Rec载体与cDNA共转化至Y187酵母菌株，利用营养缺陷型选择性培养基(SD/-Leu)筛选阳性克隆，并鉴定文库质量.结果显示：LT细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功，其文库滴度为2.33×10~8 CFU·mL~(-1),文库容量达3.5×10~9 CFU;随机挑选34个单克隆进行PCR检测，插入片段大小为250～2 000 bp,平均大小约为1 000 bp,文库重组率达100%.由此表明，本文库达到高质量文库条件，可作为研究OrfV与宿主细胞间互作机制的生物材料.
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨长庚 刘姗姗 孙冰 陈松林
为了研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)免疫及抗病相关蛋白和大分子物质的功能及相互作用机制,构建了牙鲆酵母双杂交cDNA文库。原始文库滴度为1.6×106 CFU/mL,随机选取单克隆菌落进行PCR扩增,根据PCR扩增结果表明插入片段大部分大于500 bp,平均长度约为1.5 kb,随机调取了115个EST进行了序列测定。扩增后放大文库库容约为1.8×1012 CFU。转化酵母后,文库转化效率为3.6×105CFU/μg,文库库容为5.4×106CFU。牙鲆酵母双杂交文库的构建成功为鲆蝶类免疫机理的研究,尤其是信号分子通路研究提供有效的工具。
关键词：
牙鲆:酵母双杂交 免疫相关基因 信号通路
[期刊] 华北农学报
[作者]
康国章 肖向红 王永华 郭天财 朱云集 官春云
采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号籽粒中克隆出颗粒型淀粉合成酶II基因(Granule bound starch syn-thase,GBSSII)部分cDNA片段(1 069 bp)(GenBank登录号:EF221764),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的GBSSII基因有高度的同源性。以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的GBSSII基因的反义表达载体pWM101GBSSIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了GBSSII基因的RNAi载体pFGC5941GBSSIIsa,这些载体的构建为研究GBSSII基因的功能打下了很好的基础。
关键词：
普通小麦 淀粉合成酶II基因 表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
李明 丁博 牛有雄 吕芳芳 杨文丽 孙守钧 谢晓东
以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守氨基酸序列WRKYGQK突变为WRKYGEK,为TaWRKY46的新等位基因,命名为TaWRKY46-1。采用Gateway克隆技术构建了该基因的可诱导型超量表达载体,并转化农杆菌,为接下来转基因验证TaWRKY46-1的功能奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张慧荣 赵萍萍 冯杰 王迎春 郑琳琳
黄烷酮-3-羟基转移酶(F3H)是植物黄酮合成途径上游的一个关键酶,它催化黄烷酮C3位羟化,形成二氢黄酮醇。构建长叶红砂Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。基于高通量转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂F3H3(Rt F3H3,GenBank登录号LC055546)基因,其开放阅读框长1 014 bp,编码338个氨基酸,推测蛋白分子量为38.46 k Da,理论等电点为5.7。通过定量RT-PCR研究发现,Rt F3H3在茎中表达量较高,在根和叶中表达量较低。不同程度Na Cl(100,300,500 mmol/L)和不同时间UV(12...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭强 吴昌银
为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350～2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。
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