【目的】锌指类转录因子在植物逆境信号转导和非生物胁迫响应中发挥重要的作用。通过对小麦锌指转录因子基因Ta Di19A的耐冷性能进行鉴定,利用酵母双杂交技术筛选并获得与Ta Di19A互作的候选蛋白,以解析Ta Di19A介导的抗逆调控机制。【方法】通过对低温处理的小麦转录组测序结果进行分析,获得一个锌指类转录因子Ta Di19A。利用生物信息学的方法分析Ta Di19A的分子特性,用SMART在线工具进行蛋白结构分析;用GSDS和PHYRE2在线工具分别对Ta Di19A结构和蛋白三级结构进行分析;用Ne

【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基

【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转...

为了在前期研究基础上进一步阐明小麦C2H2型锌指转录因子基因TaZAT8增强植株抵御低磷逆境的分子机制,采用蛋白质组学技术,对正常培养的野生型(WT)与过表达TaZAT8基因烟草株系蛋白表达谱进行了分析。结果表明,与WT相比,过表达株系根系中22个蛋白质的表达发生了显著变化,其中上调表达蛋白为20个,下调表达蛋白2个。然后采用LC-MS/MS质谱技术对差异蛋白进行鉴定,发现上述蛋白分别归属于物质代谢、能量代谢、逆境应答及细胞保护、转录翻译、蛋白质转换和功能未知6个类别。利用生物信息学软件进行亚细胞定位分析,22个差异蛋白主要定位于细胞质、线粒体、过氧化物酶体、细胞核和叶绿体5个不同部位,GO生物过程和分子功能分析表明,上述差异蛋白参与了不同代谢过程或体现不同类别的酶活性。结合上述分析发现,过表达TaZAT8基因通过对物质代谢、能量产生和逆境应答等生物过程的相关蛋白进行调节,为增强植株抵御逆境能力奠定了基础。

【目的】由大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV）引起的大豆花叶病是世界性大豆病害之一，利用病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术研究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中发挥的功能，为深入探讨其分子机制奠定基础。【方法】以大豆品种冀豆7号与SMV毒株SC-8、N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料，运用生物信息学预测GmSZFP的分子结构特征；以酵母转录激活试验检测其转录因子活性；借助实时定量PCR(RT-qPCR)验证GmSZFP在大豆与SMV互作中转录水平的表达特征；结合VIGS技术探究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】通过PCR克隆GmSZFP的CDS区，序列全长为1 071 bp；氨基酸序列分析和酵母转录激活试验发现GmSZFP为C2H2型锌指蛋白转录因子，且具有转录激活活性；RT-qPCR结果显示，GmSZFP受SMV的强烈诱导，在亲和组合与不亲和组合中的表达模式不同，在不亲和组合中，GmSZFP呈先上升后下降的表达趋势，其表达水平明显高于亲和组合，若在接种病毒前给叶片预注射咪唑，GmSZFP的表达水平降低，并与亲和组合相近，说明GmSZFP在转录水平响应SMV的侵染并受胞内H2O2信号调控；利用VIGS技术沉默GmSZFP后，发现接种部位胼胝质的积累水平较对照大大降低，RT-qPCR检测胼胝质合酶基因GmGSL7c和GmGSL12b的表达量较对照降低，胼胝质水解酶基因BG的表达量较对照增加；在基因沉默植株叶片上点接种SMV后72 h，病毒向外扩散至2 mm，在96 h时病毒扩散至3 mm，而对照组叶片在接种点外始终未能检测到SMV外壳蛋白CP的表达；摩擦接种SMV后10 d，在基因沉默植株的上位叶表现出花叶、失绿和卷曲等感病症状，并检测到CP的表达，说明沉默GmSZFP后，SMV在胞间扩散和长距离运输的能力均增强。【结论】大豆GmSZFP是典型的C2H2型单锌指蛋白，GmSZFP在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。

【目的】在克隆小麦锌指蛋白基因TaZAT6的基础上,深入研究该基因的分子特征和在不同磷水平下的表达特性。【方法】通过对富集石新828不同低磷胁迫时间点特异表达基因的cDNA差减文库克隆测序,获得1锌指蛋白型转录因子基因EST。利用RT-PCR技术,在低磷处理24h的石新828和冀7369根系中克隆了该锌指蛋白基因TaZAT6,并采用该技术进一步研究该基因应答介质中Pi的特征。【结果】TaZAT6开放阅读框为717bp,编码238个氨基酸残基,编码的蛋白质中含有1个保守的核定位区、2个C2H2锌指蛋白域和1个DLN保守盒。系统进化分析表明,TaZAT6可能与另外2个小麦锌指蛋白基因ZAT22和Z...

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3—5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2...

C2H2型锌指蛋白转录因子在激活胁迫相关基因、增强植物抗逆性方面具有重要的作用。以来自极端抗逆木本植物霸王C2H2型锌指蛋白转录因子基因(ZxZF)为外源基因,利用农杆菌介导法对欧美杨‘渤丰1号’进行遗传转化。经卡那霉素筛选获得80株抗性植株,通过PCR检测获得17株呈阳性植株,Southern印记杂交检测证实外源基因以单拷贝方式整合到5个转基因株系体内,RT-PCR及qRT-PCR分子检测表明,外源基因在4个转基因株系中成功表达。PEG模拟干旱胁迫试验结果初步表明,转基因株系叶片相对含水量和脯氨酸含量均显著高于非转基因植株10%以上,转基因株系抗旱性得到一定程度提高。研究表明ZxZF转录因子...

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP(basic-leucine zipper)转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过...

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子At MYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明At MYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子At MYB73的酵母诱饵表达载体p AS1-At MYB73,检测p AS1-At MYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆At MYB73的N端区域(含有R2R3结构域)和C端区域(不含R2R3结构域),检测At MYB73的N端和C端的转录激活活性,分析At MYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以At MYB73为诱饵筛选拟南芥的c DNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选...

利用cDNA-AFLP分析籼稻明恢86应答稻纵卷叶螟取食基因差异表达,发现1个与植物同源结构域(PHD)锌指蛋白高度同源的TDF,分离获得该TDF对应的粳稻全长cDNA.该全长cDNA与籼稻、玉米、蓖麻、葡萄、拟南芥和大豆等作物PHD锌指蛋白推定氨基酸序列的同源性分别为98.43%、86.01%、54.58%、57.02%、57.51%和55.88%.荧光定量PCR研究表明,日本晴(粳稻)叶片中该基因的表达也受稻纵卷叶螟取食的诱导,推测该基因与籼稻和粳稻应答稻纵卷叶螟取食密切相关.

【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白(Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973)可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白，深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作；最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×10~6和3.2×10~6 CFU·mL~(-1),平均插入片段大小在1 200 bp以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白，其中有2个MADS-box转录因子，3个E3泛素连接酶，2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达，而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白，并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1之间存在明显的互作关系。

【目的】ZmAN14是玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族成员,该家族在水稻中广泛参与非生物胁迫应答。通过分析玉米旱21(H21)及转ZmAN14烟草在非生物胁迫下的表达情况,为玉米ZmAN14及其家族的功能和分子机制的全面解析提供新信息。【方法】通过对ZmAN14进行序列分析,发现其属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。以玉米自交系H21为研究材料,在三叶期时对其进行非生物胁迫和ABA诱导处理,0、1、3、6、12和24 h时取整株样品,同时在玉米不同生长期取根、茎、叶、胚芽鞘、雌蕊、雄蕊、花丝、苞叶等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法对ZmAN14的组织表达谱和非生物胁迫及ABA...

利用矮牵牛基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的关键基因，从中发现 1 个CCCH型的锌指蛋白基因PhTZF1。通过RT-PCR分离获得该基因的cDNA全长为2 085 bp，预测其编码694个氨基酸，含有2个CCCH型锌指蛋白保守结构域。系统进化树分析发现，PhTZF1与拟南芥AtSZF1相似度最高。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性发现，正常生长条件下该基因在各组织中的表达都较弱；利用实时定量PCR检测其在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下的表达情况发现，PhTZF1表现出不同程度的上调，其中对低温胁迫最为敏感且上调倍数最高，初步推测该基因与矮牵牛应答低温...