[目的]克隆小麦Ta WRKY28基因,通过农杆菌浸染法将其转化至拟南芥,研究转基因拟南芥植株生理生化指标变化,探究其在抵御非生物胁迫中的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从小麦百农207 cDNA中克隆得到TaWRKY28基因,利用ProtParam等软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法,分析TaWRKY28基因的组织表达特异性及在NaCl、ABA、H_2O_2、干旱和低温逆境胁迫下的表达情况;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,选取TaWRKY28基因相对表达量较高的转基因T_3拟南芥株系,测定拟南芥超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性以及丙二醛(MDA)、H_2O_2和脯氨酸含量,研究TaWRKY28对拟南芥抗旱性的影响。[结果]成功克隆获得小麦TaWRKY28基因,该基因ORF全长为978 bp,编码325个氨基酸,相对分子质量为34.87 ku,理论等电点为9.27,含有1个WRKY保守结构域和1个C_2H_2锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员。序列系统进化分析结果显示,小麦TaWRKY28与大麦HvWRKY2亲缘关系最近。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。qRT-PCR结果表明,TaWRKY28在小麦根、茎、叶、雌蕊和雄蕊组织中均有表达,但具有组织特异表达性,在叶中表达量最高,雄蕊中次之,雌蕊中表达量最低,且受NaCl、ABA、H_2O_2、干旱和低温胁迫后TaWRKY28表达会增强。对TaWRKY28转基因拟南芥植株的抗旱性分析表明,在干旱条件下,转基因植株的表型优于野生型,SOD、POD活性和脯氨酸含量显著增加,而H_2O_2和MDA含量显著降低,转基因植株抗旱性显著提高。[结论]克隆了小麦TaWRKY28基因,该基因可以增强转基因拟南芥植株的抗旱能力。

在富集低磷胁迫特异表达基因的小麦根系cDNA差减杂交文库中,鉴定了1个小麦WRKY型转录因子基因(TaWRKY46)。依据该基因的cDNA序列,在石新828中克隆了该基因。TaWRKY46的cDNA长度为872 bp,开放阅读框为669 bp,编码222个氨基酸残基,氨基酸组成上含有保守的WRKY基序和C2H2基序。系统进化分析表明,TaWRKY46与大麦WRKY34可能来自相同的祖先。与对照供磷水平(2 mmol/L Pi)相比,低磷处理(20μmol/L Pi)使根系中TaWRKY46的转录本数量明显增多,表明TaWRK46对低磷胁迫逆境产生了明显应答。此外,TaWRKY46对氮、钾、锌和...

【目的】非生物逆境是制约小麦生产的主要因素。ＷＲＫＹ转录因子是植物特有的转录因子家族，参与对多种非生物逆境胁迫的应答。普通小麦基因组中至少含有２００个ＷＲＫＹ，目前仅对少数成员的功能进行了鉴定。通过克隆小麦ＷＲＫＹ转录因子ＴａＷＲＫＹ３５并揭示其功能，为改良小麦的抗逆性提供基因资源。【方法】利用小麦全长ｃＤＮａ数据信息，从强抗旱小麦品种旱选１０号中克隆逆境胁迫应答转录因子基因ＴａＷＲＫＹ３５；采用实时定量ＰｃＲ技术，分析目标基因在不同发育时期、不同组织器官中的表达水平，以及在ＰＥＧ－６０００、Ｎａｃｌ、ａＢａ和低温等逆境胁迫下的表达模式；构建目标基因与ＧＦＰ融合的表达载体，转化小麦原生质体，以．．．

【目的】Lon1蛋白酶具有降解叶绿体和线粒体内氧化蛋白、维持细胞正常代谢的功能。在分析蓝莓VcLon1时空表达模式的基础上,利用烟草遗传转化技术结合干旱生理分析,揭示蓝莓VcLon1的生物学功能,为运用生物技术培育蓝莓抗旱品种提供理论基础,并为其他植物抗旱机制研究提供基础信息。【方法】在从南高丛蓝莓‘夏普蓝’中克隆得到VcLon1全长(Gen Bank登录号:MF972079)的基础上,利用DNAMAN、MEGA4.0、Wo LF PSORT和Protparam等生物信息学软件及在线程序预测VcLon1序列及蛋白结构特征,分析比对氨基酸序列同源性并构建其同源蛋白序列进化树;同时,采用实时荧光定量PCR分析蓝莓VcLon1在不同组织及干旱条件下的表达模式;最后,构建表达载体,遗传转化本氏烟,以野生型、VcLon1超表达这2种基因型本氏烟为材料,进行干旱处理并分析二者在生物量生长、光合生理及氧化胁迫水平等方面的差异。【结果】1)PCR扩增得到VcLon1的ORF序列长2 982 bp,该序列编码993个氨基酸,预测蛋白的理论等电点为5.44,分子量为109.5 kDa。VcLon1编码的蛋白序列含有1个典型的AAA+结构域,属于AAA+超家族,定位分析编码蛋白在叶绿体和线粒体中表达,该蛋白与葡萄、苹果等Lon1蛋白酶亲缘关系较近。2)利用实时荧光定量PCR对VcLon1的表达量分析,发现其在‘夏普蓝’蓝莓各组织中均有表达,老叶中的表达量显著低于嫩叶,干旱胁迫显著提高蓝莓VcLon1的转录水平。3)干旱胁迫下各株系本氏烟生长均受到抑制,但VcLon1超表达植株均较野生型生长健壮,其中又以VL-6长势最佳,其叶片未发黄且根系发达,其株高、干质量分别比野生型高36.66%、114.29%。4)干旱胁迫下野生型本氏烟叶绿体肿胀明显且部分基粒片层结构模糊,分层不明显,而VcLon1超表达本氏烟仅部分叶绿体基粒片层空隙增大,其叶绿体超微结构未出现明显损伤,且叶片叶绿素含量高于野生型。同时,野生型本氏烟胞内线粒体普遍出现肿胀、变形,嵴断裂、解体并空泡化的现象,而VcLon1超表达本氏烟的线粒体仍维持正常椭球形。5)在氧化胁迫水平方面,VcLon1超表达植株干旱胁迫下的MDA含量均比野生型低34.38%~49.68%,且其叶片中H2O2的积累也较低,而野生型叶片的褐色面积明显上升。羰基化蛋白含量也呈现相似的变化趋势,VcLon1超表达本氏烟比相同条件下的野生型低36.89%,这可能由于VcLon1超表达植株各株系中SOD、GR、APX及POD等抗氧化酶的活性普遍显著高于野生型所致。【结论】干旱胁迫下,南高丛蓝莓‘夏普蓝’内VcLon1的运作机制可能是通过维护细胞膜系统及叶绿体的正常形态结构,同时通过降解线粒体内羰基化蛋白质,使线粒体结构保持完整、能量代谢等功能得以正常维护,减少活性氧自由基(ROS)的产生及维护抗氧化酶类活性,从而有效地降低细胞器内ROS的产生与积聚,并最终降低胞内的氧化胁迫水平,维持正常植物代谢,提高其抗旱能力。

【目的】干旱是限制小麦生产最主要的逆境因子之一。挖掘、鉴定优异抗旱新种质、克隆抗旱新基因，以期丰富我国小麦抗旱遗传基础，为小麦抗旱遗传改良提供材料。【方法】以198份从国际干旱地区农业研究中心（ICARDA）引进的抗旱种质为材料，采用PEG-6000模拟干旱方法，通过调查苗期干旱和正常条件下的地上部鲜重、地下部鲜重、生物量和根冠比4个性状，鉴定、评价其抗旱性，结合660K SNP芯片对其抗旱性进行全基因组关联分析，发掘抗旱性相关染色体区间及关联位点，结合干旱胁迫下根等多组织的表达量数据，筛选抗旱性相关基因，最后以强抗旱性品系IR214和干旱敏感品系IR36为材料，利用qRT-PCR方法对候选基因进行验证，并分析关键候选基因的优异单倍型。【结果】干旱胁迫下，小麦的生长发育受到显著抑制，各性状表型均显著低于正常对照，不同小麦品系间也表现出显著差异，4个性状在2种处理下均呈现正态分布，变异系数为0.363—0.760，多样性指数为0.310—0.400；基于加权隶属函数值（D值）综合评价各个品种的抗旱性，发现品系IR214的D值最大，为0.851，其次为IR92、IR213、IR235和IR218等，它们可作为新的优异抗旱种质；在此基础上，通过全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS），共检测到102个与4个性状抗旱系数显著关联的SNP位点，表型变异解释率范围为1.07%—38.70%，其中，与地上部鲜重相关的位点60个、地下部鲜重相关位点1个、生物量相关位点36个以及根冠比相关位点5个；基于基因组注释信息，筛选到31个抗旱相关基因，结合根等不同组织的RNA-seq数据，筛选出4个抗旱候选基因，对差异表达的候选基因进行qRT-PCR验证，鉴定到2个关键抗旱候选基因；最后，分析候选基因的单倍型效应，发现TraesCS6A02G048600的AX-86174509位点，2种基因型在抗旱性状上具有显著差异，是潜在的功能位点。【结论】共检测到102个与苗期抗旱性显著关联的位点，筛选出TraesCS5B02G053500和TraesCS6A02G048600 2个关键候选基因，TraesCS6A02G048600的AX-86174509位点是潜在的抗旱性功能位点。

【目的】MYB基因家族作为植物中最大的转录因子家族之一，在抵御逆境胁迫中发挥着重要的作用。克隆陆地棉MYB转录因子基因GhMYB108，并进行表达分析，验证其在干旱胁迫响应中的作用，为进一步研究GhMYB108调控陆地棉耐旱的分子机制奠定基础。【方法】根据干旱转录组数据分析，确定GhMYB108为干旱响应基因；运用聚合酶链式反应（PCR）从陆地棉根系cDNA中扩增目的基因；对GhMYB108进行基因结构特征、预测基因序列信息以及系统进化关系等生物信息学分析；利用Plant Care网站对获得的基因启动子序列进行分析；在不同逆境胁迫条件下，对GhMYB108的表达特性进行qRT-PCR分析；通过亚细胞定位确定GhMYB108蛋白在细胞中的位置；利用酵母试验验证其转录活性；使用病毒诱导的基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）沉默GhMYB108，并用qRT-PCR检测基因沉默效率。观察沉默株系在干旱处理前后的表型变化，并统计存活率，采用试剂盒测定相关生理生化指标；通过对棉花叶片喷施ABA与氟啶酮试验来分析GhMYB108与ABA的关系。【结果】从陆地棉中克隆了GhMYB108(Gh＿A10G1563），其全长879 bp，编码292个氨基酸，其蛋白质相对分子量为33.288 kD，等电点为6.037，多重序列比对和保守结构域分析，发现GhMYB108含有2个高度保守的MYB结合结构域，属于典型的R2R3型MYB转录因子。不同物种亲缘关系分析发现，GhMYB108与AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2的同源性较高，属于同一亚族，且已有研究发现AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2与干旱或ABA信号通路相关。GhMYB108定位于细胞核，且具有转录激活活性。在干旱和对照植株中，GhMYB108均在根中表达量最高，茎中表达量最低，并且受自然干旱、18%PEG 6000模拟干旱、盐胁迫和低温等非生物胁迫诱导表达。GhMYB108沉默之后，在自然干旱条件下，沉默植株出现临界表型，与对照相比，其萎蔫更严重，且存活率降低，一些生理生化指标也发生显著变化，如叶片失水率加快，丙二醛含量升高，叶片相对含水量和脯氨酸含量减少，过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性降低，且通过DAB与NBT染色发现植物体积累了更多过氧化氢（H_2O_2）和超氧阴离子（O_2~-）。通过对棉花叶片喷施激素ABA或氟啶酮发现GhMYB108可受ABA信号的正调控。【结论】GhMYB108正调控棉花抗旱性，且受ABA信号的正调控。

WRKY蛋白是主要存在于植物体内一类转录因子家族,在植物的生长发育和逆境应答中发挥重要作用。为了揭示小麦WRKY基因功能,从普通小麦中克隆出Ta WRKY71a基因后进行氨基酸序列分析,并对Ta WRKY71a基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,Ta WRKY71a基因编码一个含有355个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析显示,Ta WRKY71a蛋白含有1个WRKY结构域及1个C2H2锌指结构。预测分析表明,Ta WRKY71a蛋白定位在细胞核;其二级结构包含28.17%的α-螺旋、16.34%的延伸链、4.79%的β-转角和50.70%的无规则卷曲。不同物种间WRKY蛋白的同源性分析比较表明,Ta WRKY71a与粗山羊草WRKY71、水稻WRKY71、高粱WRKY71和拟南芥WRKY40的氨基酸序列之间具有高度的保守性。q RT-PCR分析表明,Ta WRKY71a在叶、根、茎、花和种子中均有不同程度表达,并受ABA、Na Cl和PEG诱导表达,推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答。研究结果为进一步研究Ta WRKY71a的生物学功能奠定了基础。

C2H2型锌指蛋白转录因子在激活胁迫相关基因、增强植物抗逆性方面具有重要的作用。以来自极端抗逆木本植物霸王C2H2型锌指蛋白转录因子基因(ZxZF)为外源基因,利用农杆菌介导法对欧美杨‘渤丰1号’进行遗传转化。经卡那霉素筛选获得80株抗性植株,通过PCR检测获得17株呈阳性植株,Southern印记杂交检测证实外源基因以单拷贝方式整合到5个转基因株系体内,RT-PCR及qRT-PCR分子检测表明,外源基因在4个转基因株系中成功表达。PEG模拟干旱胁迫试验结果初步表明,转基因株系叶片相对含水量和脯氨酸含量均显著高于非转基因植株10%以上,转基因株系抗旱性得到一定程度提高。研究表明ZxZF转录因子...

<正>小麦（Triticum aestivum L.）是全球最重要的粮食作物之一，在全球气候变化和水资源紧缺的背景下，干旱缺水成为限制小麦生产最主要的逆境因子之一，选育抗旱节水品种是小麦应对环境胁迫的重要途径。小麦的抗旱性研究涉及多个方面，包括小麦不同生长时期抗旱指标的建立、抗旱基因的挖掘与鉴定、抗旱相关优异等位基因的挖掘和利用、抗旱品种的筛选与评价等。从多个维度综合研究小麦抗旱性，有利于理解小麦的生长适应机制，加速抗旱品种的选育与推广，

牛枝子为胡枝子属中最具耐旱特性的灌木树种,是研究基于单核苷酸多态性(SNP)水平的植物个体间耐旱差异机制的重要材料。以5个种源的天然牛枝子为材料,利用染色体步移技术克隆牛枝子抗旱候选基因LpDREB的全长序列,对LpDREB基因的结构和系统进化进行分析,研究LpDREB基因的组织及诱导表达规律,分析LpDREB基因的SNP分布和类型。研究结果表明:克隆的牛枝子LpDREB基因cDNA片段全长为1611bp,具有957bp的开放阅读框,编码318个氨基酸,包含DREB基因所特有的DREBP/AP2保守区域。LpDREB基因同大豆GmDREB3基因的进化关系最近,但2个基因除保守区域外的其他区域相...

为探究不同干旱胁迫时间处理下，二倍体马铃薯材料对干旱胁迫响应的分子机制，挖掘抗旱相关基因。以高抗旱二倍体资源A90为试验材料，利用转录组测序技术对PEG-6000胁迫下不同时间的差异表达基因进行分析，通过GO富集、KEGG通路分析与转录因子预测参与马铃薯干旱胁迫响应的差异表达基因，初步挖掘抗旱调控关键基因；并通过RT-qPCR对3个抗旱候选基因进行逆境胁迫表达分析。结果表明：A90在20%PEG-6000胁迫处理3,6,24 h与对照相比，共有2 519个差异表达基因，这些基因主要富集在植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等抗旱相关过程中。并且显著富集在通路上的340个共差异表达基因中有53个基因注释到了RLKs、AP2/ERF和Tify等15个转录因子家族中，其中StST/K1、StERF1和StTify1的表达量较高，有可能是抗旱调控关键基因。基因StST/K1和StERF1受到干旱和低温胁迫主要在材料的根和叶中上调表达，基因StERF1在盐胁迫下在材料的根、茎和叶中均上调表达；基因StTify1在受到干旱在材料的茎和叶中上调表达，受到盐胁迫在材料的根、茎和叶中均上调表达，但在低温胁迫下只在材料的茎中下调表达。由此说明，筛选出的3个基因均能够对干旱、盐和低温胁迫产生响应，可为今后马铃薯抗旱分子育种中相关抗旱候选基因研究提供一定的理论基础。

分析了不同匍匐翦股颖草坪草品种在干旱环境下AsEXP1基因的表达状况,发现AsEXP1基因的表达与草坪草品种的抗旱性呈显著正相关关系,亦即在耐旱草坪草品种中表达,而在不耐旱草坪草品种中不表达。对耐热但不耐旱草坪草品种‘PennA-4’的进一步检测分析发现,AsEXP1基因经高温诱导表达后,显著增强了‘PennA-4’品种的耐旱性。

为进一步挖掘小麦逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究小麦逆境胁迫响应机制,从前期转录组结果中筛选出1个编码MYB蛋白的基因,暂命名为Tamyb59,通过PCR技术扩增Tamyb59的全长;利用NCBI和DNAMAN软件进行基因序列比对和保守结构域的分析;利用Expasy和TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、亲水系数分析;采用MEGA 6. 0软件构建系统进化树;构建pMDC83-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。采用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,并利用SAS数据处理软件进行差异显著性分析。结果表明:该基因含有典型的SANT保守结构域,CDS序列全长为522 bp,编码173个氨基酸,编码蛋白分子质量为19. 7 ku,理论等电点为7. 61。基因系统进化分析结果表明,Tamyb59与山羊草、粳稻、玉米等9种植物MYB转录因子有52. 0%～85. 6%的同源性,其中与谷子的MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,Tamyb59基因编码蛋白定位在细胞核。利用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,组织表达特异性分析显示,Tamyb59基因在小麦根中的表达量较高,茎、叶和幼穗中表达量较低; PEG和盐胁迫处理过程中,Tamyb59基因的表达均呈现先上升后下降的趋势,说明Tamyb59基因对不同非生物胁迫有不同的响应。

【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因，明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法，从小麦条锈菌中获得PsSte12基因，利用生物信息学分析其序列特征，实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征；借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12，该基因序列含有1个全长2 553 bp的开放阅读框；基因组DNA序列含有4个内含子，分别位于开放阅读框第281，429，1 512，1 584位，长度分别为7