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[期刊] 中国农业科学
[作者]
于太飞 徐兆师 李盼松 陈明 李连城 张俊华 马有志
【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3—5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
明川 拓昊苑 陶怡 于好强 李晚忱 付凤玲
【目的】筛选玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting protein kinase 2,SnRK2)的底物蛋白,鉴定其在玉米脱落酸(Abscisic acid,ABA)信号转导中的作用,为进一步解析玉米中ABA介导的非生物逆境抗性机制提供参考。【方法】根据前期研究结果,通过与拟南芥SnRK2已知底物蛋白的序列比对和保守基序分析,从磷酸化水平响应ABA诱导且上调的238个蛋白中预测ZmSnRK2作用的底物蛋白,用酵母双杂交试验验证ZmSnRK2家族成员与候选蛋白的相互作用,分析其在玉米ABA信号转导中的作用。【结果】从前期鉴定的玉米磷酸化水平响应ABA诱导且上调的238个蛋白中,预测出10个ZmSnRK2候选底物蛋白,实际扩增出其中8个蛋白的编码基因以及10个ZmSnRK2基因家族成员。酵母双杂交试验结果表明,GenBank序列号为XP_008666965.1、NP_001142137.1和XP_008656995.1的候选底物蛋白,因自体磷酸化不能用酵母双杂交检测,GenBank序列号为NP_001183680.1的候选底物蛋白可以与ZmSnRK2.1、2.2、2.4、2.5、2.7、2.8、2.10、2.11蛋白相互作用,GenBank序列号为NP_001145831.1和NP_001167942.1的候选底物蛋白分别可以与ZmSnRK2.1和ZmSnRK2.10蛋白相互作用。【结论】NP_001183680.1和NP_001167942.1蛋白是ZmSnRK2家族部分成员的磷酸化底物,是玉米ABA信号转导途径的下游组分;NP_001183680.1蛋白与拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶同源,NP_001167942.1蛋白为包含SAM结构域的蛋白,这2个蛋白均涉及许多生理生化过程,说明ZmSnRK2下游的ABA信号转导呈发散状。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨桦 李祥乾 王帆 方睿 杨伟
【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和Cbuq PBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
叶竞阳 王建云 熊小波 陈大松 谢福莉 李友国
以紫云英类受体蛋白激酶Ｎｉｐ４３的Ｓ－ＴＫＳ结构域构建诱饵载体，通过酵母双杂交技术，筛选获得１７个候选的阳性克隆。经过测序分析和ＢｌａＳＴ比对，最终确定了１个互作蛋白ＥｐＮ。ＥｐＮ蛋白是网格蛋白聚合反应中的配体蛋白，可调控网格蛋白的聚合反应。通过实验验证显示，靶蛋白ＥｐＮ与Ｎｉｐ４３蛋白互作最强的区域为ＥＮＴＨ／ａＮＴＨ结构域。ＲＥａｌ－ＴｉｍＥ ｑ ｐＣＲ检测表明，ＥｐＮ基因参与了根瘤菌早期结瘤过程。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
翟朝增 徐兆师 陈耀锋 刘沛 李连城 陈明 马有志
【目的】克隆小麦蛋白激酶基因TaNPK启动子,并分析5′非编码区对盐胁迫的响应,探索TaNPK的调控机制,为解析小麦抗盐机制提供理论依据。【方法】利用染色体步移技术从小麦中分离TaNPK读码框上游序列,构建启动子缺失突变体,在PEG4 000介导下将重组质粒转入拟南芥叶片原生质体进行瞬时表达分析,以gus为报告基因研究不同调控序列的活性及盐诱导性分析。【结果】获得了TaNPK读码框上游2 004 bp的启动子序列,PEG介导的拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,5′端缺失片段都在不同程度上驱动了GUS的表达;经过NaCl处理后的原生质体,GUS的表达量比不经处理的对照组明显提高,这与NaCl处理下...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙海桃 徐兆师 侯建华 于卓 赵月 李连城 陈明 马有志
【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
范延艮 王域 刘富浩 赵秀秀 向勤锃 张丽霞
【背景】‘黄金芽’属于光照敏感型黄化茶树（Camellia sinensis）品种，叶片色泽呈现强光黄化、弱光复绿的特点，但叶色响应光照的黄化机制并不明确。前期通过对黄化叶片、遮阴复绿叶片以及常绿品种叶片的蛋白组研究发现，重金属相关异戊二烯化植物蛋白CsHIPP26.1(TEA000549)的表达响应光照强度，表明CsHIPP26.1可能参与调控‘黄金芽’叶色黄化的光响应过程。【目的】通过筛选与CsHIPP26.1互作的光信号响应相关的蛋白，为叶片色泽响应光照信号变化提供科学依据。【方法】以‘黄金芽’茶树1芽2叶为材料进行CsHIPP26.1和互作基因的克隆，经酵母双杂交筛库，然后将筛选得到的目的蛋白进行酵母双杂交点对点验证、体内双分子荧光互补（BiFC）和体外pull-down等技术进行蛋白互作的进一步验证。【结果】通过酵母双杂交对茶树cDNA文库进行筛选，共筛选到26个候选互作蛋白，主要集中在细胞组分、结合以及催化活性方面发挥作用，其中生物素合成代谢过程富集程度较高，与光信号通路及叶绿素合成相关的蛋白只有编号为TEA026466.1的bHLH30转录因子。克隆bHLH30转录因子后发现，该转录因子与茶树光信号传导途径蛋白PIF4处于同一进化树分支，且含有与茶树PIF4蛋白相同的HLH和ACT结构域，将该bHLH30转录因子命名为CsPIF4.2,GenBank登记号为MW116834。进一步通过体外Pull-down蛋白互作和体内双分子荧光互补（BiFC）验证发现，CsHIPP26.1和CsPIF4.2蛋白能够发生互作，并且发生互作的部位在细胞核内。【结论】初步筛选出26个与CsHIPP26.1互作的蛋白，并验证发现CsHIPP26.1能够在细胞核内与其中一个光敏色素互作因子CsPIF4.2发生蛋白相互作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
余义和 李秀珍 郭大龙 张会灵 杨英军 李学强 张国海
【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶ＶＶ ＣＩＰＫ１０，分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式，为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能，探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得ＶＶ ＣＩＰＫ１０序列，设计特异引物进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析；构建原核表达载体，转化表达菌株后用ＩＰＴＧ进行诱导表达，收集菌体后裂解细胞，制备蛋白上样液，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳对表达产物进行分析，同时对融合蛋白进行可溶性分析；ＩＰＴＧ大量诱导表达融合蛋白，收集菌体后进行超声破碎细胞，用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化ＭＢＰ－ＶＶ ＣＩＰＫ１０融合蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王呈玉 张明哲 吕世友 李彦舫
【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
茹京娜 于太飞 陈隽 陈明 周永斌 马有志 徐兆师 闵东红
【目的】锌指类转录因子在植物逆境信号转导和非生物胁迫响应中发挥重要的作用。通过对小麦锌指转录因子基因Ta Di19A的耐冷性能进行鉴定,利用酵母双杂交技术筛选并获得与Ta Di19A互作的候选蛋白,以解析Ta Di19A介导的抗逆调控机制。【方法】通过对低温处理的小麦转录组测序结果进行分析,获得一个锌指类转录因子Ta Di19A。利用生物信息学的方法分析Ta Di19A的分子特性,用SMART在线工具进行蛋白结构分析;用GSDS和PHYRE2在线工具分别对Ta Di19A结构和蛋白三级结构进行分析;用Ne
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张恒 尹珺 张晴 张忠明
为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白。结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
倪天华 魏幼璋
简要介绍了钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependentProteinKinases,CDPKs)的结构特点及家族成员,重点对CDPKs在植物环境胁迫、防御反应、生长发育、离子通道调节和激素信号等方面的生理功能研究进展进行了综述和讨论,并展望了该领域的研究前景。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
麻浩 王爽 周亚丽
钙是植物必需的大量元素之一,同时钙离子(Ca(2+))是细胞信号转导的第二信使。钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)作为Ca(2+)的感受器普遍存在于植物和部分原生动物中,是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,参与了多种Ca(2+)介导的信号通路,在植物发育信号和逆境信号转导中具有重要作用。本文概述了钙依赖蛋白激酶在植物体内的分布、结构、底物、功能以及大豆CDPK的研究进展,旨在为今后培育抗逆植物品种提供参考依据。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
郑秀文 崔鹏 石嘉伟 杨静静 陈敏敏 郑瑶 许玲 刘宏波
CCHC型锌指结构蛋白Os ZFP参与调控水稻Oryza sativa侧根的生长发育,但其相关互作蛋白及调控机制未知。以水稻‘日本晴’‘Nipponbare’为试验材料,克隆了Os ZFP基因,利用Eco RI和Sal I酶切位点构建酵母双杂交钓饵表达载体p GBKT7+Os ZFP,验证该表达载体对酵母菌株Y2H无毒性及报告基因自激活现象;采用酵母双杂交技术,从已构建的水稻c DNA文库中筛选到1个阳性互作蛋白,经美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)同源性比对,鉴定为含有T-complex pol
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李叶 廖丽丽 许婷 张怀渝 郭晋雅
为了解不同类受体蛋白激酶RLKs激酶域响应病原相关分子PAMPs信号强度的差异,本研究将拟南芥FLS2的胞外域(NT)与6种不同RLKs的激酶域(KD)组合为重组RLKs(rRLKs),构建融合基因表达载体,并通过拟南芥原生质体瞬时表达的方法,将rRLKs/FLS2、35S::GUS(内参)和FRK1::Luciferase(响应报告载体)共转化到拟南芥fls2突变体叶肉原生质体细胞中;后经flg22处理后,通过对萤光素酶(Luciferase)和葡糖苷酸酶(GUS)活性的定量分析和比较,鉴定不同RLKs
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