目的对小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)进行亚细胞水平定位以及功能鉴定。方法构建Tagsk1-gfp融合基因表达载体并转化拟南芥,以仅携带gfp基因的拟南芥作为对照,利用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白在转基因植株根部细胞的分布;利用含不同浓度NaCl的MS培养基对携带有融合基因的拟南芥和Columbia型拟南芥进行耐盐性鉴定,观察主根生长量和侧根生长数目。结果发现TaGSK1存在于细胞质内,且该激酶在根尖分生组织和与侧根发生有关的中柱鞘细胞中分布较多;耐盐性鉴定结果表明,转Tagsk1-gfp融合基因的植株的平均主根生长量和侧根生长数目与Columbia型拟南芥植株的差异均达到极显著水平(P<0...

以中国春缺体-四体系为材料,提取各材料的基因组DNA,分别经限制性内切酶EcoRI和KpnI完全酶切、电泳、转膜后,用α-32P_dCTP标记的与小麦耐盐相关的糖原合成酶激酶基因TaGSK1为探针进行杂交,结合生物信息学的方法,将该基因定位于普通小麦第一同源群染色体的短臂上,为进一步研究小麦耐盐性的遗传及机理奠定了基础。

观测稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)糖原合成酶激酶基因Mo GSK3敲除突变体表型,明确Mo GSK3在稻瘟菌中的潜在生物学功能,为挖掘防治稻瘟菌新型药剂的潜在靶标提供参考。【方法】基于同源重组原理,用split-PCR方法获得稻瘟菌Mo GSK3敲除突变体菌株,将Mo GSK3基因克隆到p FL2载体上得到Mo GSK3-C融合载体,并将其通过PEG介导的原生质体转化法导入Mo GSK3突变体中得到回补菌株。培养观察野生型菌株Guy11、突变体菌株G3-9及回补菌株GC-1的菌落形态和生长状况,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测稻瘟菌产孢相关基因的表达量;观察稻瘟菌不同菌株的分生孢子形态,通过附着胞洋葱表皮穿透试验及接种水稻叶片,研究其致病力;通过KI-I2染色对野生型菌株Guy11及突变体菌株G3-9分生孢子和附着胞中的糖原运输能力进行观测。【结果】稻瘟菌Mo GSK3突变体存在多个表型缺陷,与野生型菌株Guy11相比,Mo GSK3突变体菌株G3-9菌落直径显著变小,生长缓慢,产孢相关基因表达量下降且分生孢子出现末端伸长畸形的状态。Mo GSK3基因缺失还会导致稻瘟菌菌丝末端无法形成正常的分生孢子梗,附着胞无法穿透洋葱表皮形成侵染菌丝,接种划伤水稻叶片也无法形成褐色病斑。对Mo GSK3突变体菌株G3-9分生孢子及附着胞进行糖原染色后发现,突变体菌株G3-9在糖原转运能力方面存在明显缺陷。【结论】Mo GSK3基因参与稻瘟菌的生长、分生孢子形成及形态建成、侵染、糖原转运等过程,是稻瘟菌重要的毒力因子。

前期研究证明糖原合成酶激酶(GSK3β)在花生黄曲霉敏感品种中上调表达。本研究对花生黄曲霉抗性品种和易感品种发育种子表达的GSK3进行了生物信息学和定量PCR的分析验证。结果表明,在抗性品系中,GSK3β基因在小果时期上调表达。由于GSK3β是油菜类甾醇信号传导的负调控因子,在细胞延长中起着抑制作用。因此推测GSK3β在花生果实发育中是种子和果实大小的抑制因子,与黄曲霉抗性有间接或直接的关系。

【目的】Cks1(cyclin-dependent kinase subunit 1)是细胞周期蛋白依赖性激酶复合体CDK(cyclin-dependent kinase)的结构亚基，是细胞周期调控过程中的关键基因。论文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）StCks1，分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StCks1表达量差异及其互作蛋白，为进一步研究StCks1在附着胞发育中的作用打下基础。【方法】通过对玉米大斑病菌野生型菌株01-23全基因组数据分析，获取StCks1蛋白序列；利用软件MEGA 5.0和在线数据库Pfam、SMART对酿酒酵母、裂殖酵母和拟南芥等物种Cks1蛋白进行系统发育树构建和保守结构域分析；收集玉米大斑病菌附着胞发育不同时期样品进行转录组测序以及表达量分析。利用原核诱导表达系统，构建原核表达载体pGEX-6p-3-StCks1，并转化大肠杆菌表达菌株BL21，对重组蛋白GST-StCks1诱导表达纯化；通过GST pull-down、Western blot技术和酵母双杂交试验，鉴定StCks1的互作蛋白。【结果】玉米大斑病菌全基因组中鉴定到唯一StCks1蛋白编码基因，该蛋白由130个氨基酸组成；其三级结构主要由4股β折叠和3个α螺旋构成，含有HxPEPH(His-anyPro-Glu-Pro-His)保守位点和Cks保守结构域；通过转录组测序和表达量分析发现，StCks1在附着胞发育不同时期表达量显著上调；重组蛋白GST-StCks1在1 mmol·L-1 IPTG,30℃诱导2 h可获得大量可溶性蛋白；通过GST pull-down技术获取大量互作蛋白并进行质谱鉴定，通过Western blot和酵母双杂交试验，验证StCks1与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1存在互作。【结论】玉米大斑病菌中含有唯一的StCks1，通过与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1互作调控附着胞的发育。

【目的】小麦果聚糖合成酶基因6-SFT是果聚糖合成过程中的关键酶基因,研究6-SFT-A的多态性,分析其与小麦苗期抗旱性的关系,并进行遗传定位。【方法】以苗期抗旱性不同的30份六倍体小麦和4份小麦A基因组供体种乌拉尔图小麦为材料,通过直接测序分析6-SFT-A的单核苷酸多态性(SNP)及其与抗旱性的关系;开发基因分子标记,利用RIL群体(偃展1号×内乡188)对该基因进行遗传定位。【结果】在30份六倍体小麦材料中检测到14个核苷酸多态性位点,包括13个SNP和1个InDel,平均234 bp检测到一个多态性位点,仅在1 727和1 781 bp 2个位点检测到非同义突变;在4份乌拉尔图小麦中检...

针对目前有关淀粉理化特性方面的研究相对落后的状况,对相关文献进行分析。首先分析小麦籽粒淀粉需要的几种关键酶:ADP-葡萄糖、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脱分支酶,其次对国内外小麦淀粉合成酶研究方面的进展进行了综述。

【目的】克隆小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因(Ps Pik1),分析其在小麦条锈菌生长发育与致病过程中的作用。【方法】利用RT-PCR技术克隆Ps Pik1的c DNA序列,采用生物信息学技术分析该基因编码蛋白分子特征并构建进化树;运用实时荧光定量PCR技术,选用小麦条锈菌的延伸因子(elongation factor,EF)作为内参,明确该基因在小麦条锈菌夏孢子阶段和侵染小麦后6、12、18、24、36、48 h以及3、5、7、9、11 d共12个发育时期的表达特征;利用病毒介导的基因沉默技术(BSMV-hos...

为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因，该基因编码区全长为3 165 bp,编码蛋白的长度为1 055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30a-StSPS1,进行了StSPS1蛋白的诱导、变性、纯化、复性及兔免疫试验。结果发现，StSPS1蛋白分子量约为119.62 ku,在可溶性上清中的表达极少，主要在不溶的沉淀中表达，最佳的诱导条件为37℃下用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h。由于StSPS1为包涵体蛋白，故对其进行包涵体变性处理，并利用His标签纯化出了与目的条带大小相符的蛋白，同时通过His抗体进行了蛋白质免疫印迹(WB)试验，发现在119.62 ku处检测到目标条带，说明StSPS1包涵体蛋白纯化成功。最后，通过将透析复性后的StSPS1蛋白注射进兔子皮下组织中，成功免疫出2个StSPS1的抗体，经过WB鉴定发现2个抗体均能在抗原和川芋10号叶片的总蛋白中杂出目标条带。综上，对马铃薯StSPS1蛋白进行了诱导及纯化，并成功制备了StSPS1蛋白的兔多克隆抗体。

通过硝基蓝四唑(NBT)还原法和血细胞形态法两种一氧化氮合成酶的鉴定方法,以日本对虾(Penaeusjaponicus)作为研究对象,对日本对虾血细胞中的一氧化氮合成酶进行初步鉴定,并优化硝基蓝四唑(NBT)还原法测定对虾血细胞中一氧化氮合成酶的实验条件。结果显示,当L-精氨酸浓度为2.5mmol/L,脂多糖(LPS)质量浓度为100μg/mL,Ca2+浓度为2.5mmol/L时,NBT法测定一氧化氮合成酶活力的结果最佳。同时,还建立了两种针对一氧化氮合成酶活力的分析方法—L-瓜氨酸分析法和亚硝酸盐分析法,并对其测定条件进行了优化。结果表明,对虾血细胞在4℃下与L-精氨酸和LPS孵育8h后测定...

生长素通过其结合蛋白(ABP1)促进细胞纤维素合成并使细胞伸长生长。为探明ABP1与纤维素合成酶(CesA1)这2种蛋白质之间的相互关系,分别对这2种蛋白质进行了荧光标记,构建了绿色荧光蛋白(GFP)对ABP1融合标记以及青色荧光蛋白(CFP)对CesA1融合标记的2种载体。采用烟草叶片侵注法,将2种重组体转入烟草叶片同一细胞进行瞬时表达。扫描激光共聚焦显微成像观察到转基因瞬时表达的烟草铺列细胞的细胞膜上有强烈两色荧光信号,表明这2种蛋白集中在细胞膜上分布,其分布区域存在明显的重叠。在细胞的内膜系统中绿色荧光信号相对较强,青色荧光信号较弱,表明内膜系统中也分布着一定量的ABP1,而纤维素合成酶...

【目的】蛋白磷酸化在介导非生物逆境信号的转导中具有重要作用。以笔者在低磷胁迫下鉴定的小麦促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)基因TaMPK1a-1为基础,开展该基因应答低磷逆境分子特征的研究。【方法】利用cDNA-AFLP技术,鉴定特异上调表达的MAP激酶基因TaMPK1a-1。采用生物信息学技术研究基因结构和编码蛋白特征,采用半定量RT-PCR技术研究TaMPK1a-1应答低磷胁迫逆境的分子特征。【结果】TaMPK1a-1 cDNA长度为2170bp,开放阅读框为1737bp,编码578个氨基酸残基。TaMPK1a-1含有2个参与双重磷酸化作用的TEY和TDY基序。在正常供磷条件下,磷高效品种...

【背景】海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)在海藻糖合成中起着重要作用,其能够介导海藻糖代谢调控几丁质合成及昆虫发育。【目的】本研究通过抑制白背飞虱(Sogatella furcifera)TPS的表达,检测RNAi沉默SfTPS效果,观察白背飞虱蜕皮状况,测定几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)基因的定量表达,探究SfTPS在白背飞虱几丁质合成中的潜在调控作用。【方法】利用注射法RNAi技术,以实验室饲养多年的白背飞虱种群为试验材料,体外合成两个SfTPS(SfTPS1和SfTPS2)与GFP的双链RNA(dsRNA)后,分别注射到白背飞虱体内抑制TPS。首先,在dsRNA注射后48 h采用Trizol法提取白背飞虱的总RNA,反转录并合成第一链DNA后,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测TPS表达沉默情况,以确定RNAi的效果;其次,测定dsRNA注射后48 h和72 h白背飞虱整体几丁质含量并对翅发育畸形虫体进行拍照;最后,采用qRT-PCR技术检测白背飞虱SfCHS在mRNA水平上的相对表达量变化,分析SfTPS1和SfTPS2在几丁质合成调控中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,dsSfTPS1和dsSfTPS2的RNA注射后,能够促进SfCHS表达量上升,几丁质含量增加,白背飞虱成虫翅出现畸形。qRT-PCR结果显示,单个SfTPS dsRNA注射后本基因的表达能够被极显著抑制,与注射dsGFP相比,不足对照组表达量的30%,且单个SfTPS的dsRNA注射后,另外一个SfTPS表达同样显著下降;dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后,白背飞虱成虫翅均为长翅,出现一定比例的翅卷曲等畸形情况,其后48 h和72 h产生一定的死亡率;几丁质含量检测发现,SfTPS1和SfTPS2的dsRNA注射后72 h,几丁质含量显著上升。与注射dsGFP对照组相比较,SfCHS1与SfCHS1a表达量在dsSfTPS1注射后72 h极显著上升,在dsSfTPS2注射后48 h和72 h时极显著上升,且dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后SfCHS1b的表达极显著增加。【结论】SfTPS能够通过调控白背飞虱几丁质合成酶基因的表达来控制几丁质的合成,研究结果有助于评价SfTPS在白背飞虱等昆虫中的调控作用并作为潜在控害靶标,为进一步开展和筛选有效的海藻糖合成酶抑制剂控制白背飞虱等害虫提供理论依据。

以冬小麦农大93(单核期花药)为实验材料,运用 Mg~(2+)-ATP 酶电镜细胞化学定位方法对高温(45±0.5)C 处理(0～30min)后花药的 Mg~(2+)-ATP 酶变化特点观察结果表明:单核期花药中不同部位的 Mg~(2+)-ATP 酶活性表现为绒毡层细胞酶活性>乌氏体和小孢子外壁及其内膜>表皮、内壁和中层。高温处理绒毡层细胞、小孢子质膜和细胞器膜最易破碎,并伴随 ATP 酶活性下降,其下降幅度明显高于其他部位。由此可见,绒毡层细胞和小孢子的 Mg~(2+)-ATP 酶活性及膜结构对高温比花药的表皮、内壁和中层敏感。

研究了小麦叶片内1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rub isco,EC 4.1.1.39)大亚基(LSU)由53 000裂解为50 000的反应。结果显示,成熟叶片的粗提液在pH 5.5的条件下反应后能检测到50 000的裂解产物,而暗诱导衰老叶片的粗提液在pH 7.5的条件下也能发现LSU的这一降解。分别从成熟叶片和衰老叶片中提取叶绿体,以其裂解液为反应体系研究LSU由53 000裂解为50 000这步反应的细胞器定位。结果显示,衰老叶片中的叶绿体裂解液在pH 7.5时反应1 h后能检测到50 000降解产物,而成熟叶片叶绿体裂解液在pH 5.5和pH 7.5的条件下反应后均未检测到LS...