利用简并引物从小豆中扩增出1条与植物几丁质酶基因高度同源的片段,命名为VaAC1,通过RACE技术延伸VaAC1基因的3'端和5'端,VaAC1基因完整ORF长度为885 bp,编码294个氨基酸,拥有几丁质酶蛋白家族典型保守结构域GH18_chitinase-like。RT-PCR分析表明,VaAC1基因在小豆根、茎和叶中均有表达,且在叶中的表达相对较高;大豆花叶病毒处理后,VaAC1基因在叶中的表达量显著增强,显示小豆VaAC1基因与病毒病密切相关。

为探究RPM1在高粱抗病过程中的作用，以高粱抗黑穗病品种SX44B为材料，采用同源克隆法获得一个高粱SbRPM1基因。生物信息学分析结果显示：该基因的cDNA全长2 802 bp,预测共编码933个氨基酸。该基因编码蛋白的理论分子质量为106.1 ku,等电点为7.11,为亲水性蛋白质；该蛋白无跨膜结构，亚细胞定位在细胞质中。保守结构域分析显示，SbRPM1蛋白含有RX-CC-like、NB-ARC和LRR结构域，属于NLRs受体蛋白家族中的CNL类蛋白。系统发育关系分析表明，SbRPM1蛋白与南荻RPM1蛋白亲缘关系最近。通过实时荧光定量PCR技术检测SbRPM1基因的表达模式，结果表明，该基因在叶和花序中表达量较高，其次是根，在茎中表达量最低。在接种丝黑穗病原菌后24～72 h抗病品种中SbRPM1基因的表达显著上调，表明该基因受病原菌诱导表达，在高粱抗病反应中扮演着重要角色。首次在高粱中克隆得到SbRPM1基因CDS序列，解析了该基因的结构、性质与表达的特征。

迟缓爱德华氏菌病是海水鲆鲽鱼类的主要病害，发掘抗病分子标记辅助育种是十分有效的策略。本研究以牙鲆(Paralichthys olivaceus) rnd1基因(Pornd1)为对象，对该基因在牙鲆抗病免疫方面的作用进行系统分析。首先对Pornd1基因进行克隆鉴定和抗病相关单核苷酸多态性位点的定位。利用荧光定量PCR对Pornd1基因的组织分布、细菌感染后表达情况以及在抗病和易感家系中的表达水平进行检测。结果显示，Pornd1 cDNA开放阅读框为699 bp，编码232个氨基酸。结合前期GWAS分析数据，本研究对Pornd1基因扩增和测序，确定Pornd1基因内含子2上存在一个抗迟缓爱德华氏菌病相关单核苷酸多态性位点，该位点在易感家系和抗病家系中分别是C/T，抗病家系(freq_(T)=0.92)高于易感家系(freq_(T)=0.20)，具有显著性差异(P

【目的】克隆山黧豆抗氧化酶基因,并对其进行生物信息学及表达模式分析,为研究抗氧化酶基因在山黧豆中的抗旱机制奠定基础。【方法】以萌发7 d的山黧豆叶片为材料,通过RT-PCR克隆山黧豆抗氧化酶基因的编码序列(CDS);采用荧光定量PCR分析抗氧化酶基因的组织表达模式;利用在线软件ExPASy ProtParam、SignalP 4.1、TMHMM V. 2.0、TargetP 1.1分别分析抗氧化酶基因编码的蛋白质理化性质、信号肽、跨膜区域以及亚细胞定位;利用在线工具Conserved Domain、SOPMA预测蛋白质保守结构域和二级结构,利用MEGA 6.0软件构建蛋白系统进化树;并利用20%PEG 6000溶液模拟干旱处理山黧豆,采用荧光定量PCR分析干旱胁迫不同时间抗氧化酶基因在叶片中的相对表达量。【结果】RT-PCR克隆获得山黧豆抗氧化酶基因APX、CAT、MnSOD、FeSOD和Cu/ZnSOD的编码序列,其长度分别为864,1 485,723,1 005和942 bp。生物信息学分析表明,APX、CAT、MnSOD、FeSOD和Cu/ZnSOD抗氧化酶均为酸性不稳定蛋白质,且均由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲共4种二级结构组成;山黧豆抗氧化酶均包含高度保守的结构域。聚类分析结果表明,山黧豆的APX、CAT、MnSOD、FeSOD、Cu/ZnSOD依次与蒺藜苜蓿、蚕豆、豌豆、豌豆和锦鸡儿具有较高的相似性、较近的亲缘关系和遗传距离。表达分析结果表明,APX、CAT、MnSOD、FeSOD和Cu/ZnSOD基因在山黧豆根、茎、叶组织中均有表达。APX、CAT和MnSOD基因均响应了干旱胁迫,其中APX、CAT基因的表达量在干旱胁迫后迅速升高,3 h后达到最高,分别是0 h的5和4.3倍。【结论】成功克隆了山黧豆抗氧化酶基因APX、CAT、MnSOD、FeSOD和Cu/ZnSOD,推测其可协同清除干旱胁迫下产生的活性氧。

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PC...

【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因ＣＩＭＹＢ转录因子，进行生物信息学及表达模式分析，为进一步解析ＣＩＭＹＢ在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和ＭＩＣｒｏａｒｒａＹ数据分析，获得与西瓜抗枯萎病相关的基因ＣＩＭＹＢ，采用ｒＴ－ＰＣｒ技术分离克隆ＣＩＭＹＢ Ｃ ＤＮａ全长序列；应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征；使用ＭＥＧａ５．０对ＣＩＭＹＢ蛋白序列及其同源序列进行多序列比对，并构建同源物种间系统进化树；采用ＧＦＰ标记的方法进行亚细胞定位，分析编码蛋白表达位置；将该基因片段通过ＮＤＥ Ｉ和ＸＢａ Ｉ双酶切连接至原核表达载体Ｐ Ｃｚ．．．

为了探究ERF转录因子家族与棉花枯萎病抗性之间的关系,也为海岛抗枯萎病品种的选育工作提供新的基因资源,从Solexa高通量测序技术建立的棉花基因表达谱中筛选探针序列,通过电子克隆结合RT-PCR技术从高抗枯萎病的棉花品种中棉所12中克隆到一个新的ERF-B1亚组转录因子基因,命名为Gh ERFB101(Gen Bank:KF850521)。序列分析表明,该基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域,在进化上与拟南芥At ERF11的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,枯萎病菌诱导后,Gh ERFB101基因在抗病品种根中的表达量呈现下降趋势;而在感...

MLO基因作为感病因子在调控寄主植物对白粉病的应答反应中发挥着重要作用。为明确苦瓜McMLO1基因在白粉病胁迫下的基因功能，以苦瓜自交系K24为材料对该基因进行了克隆、生物信息预测及表达分析。结果表明，McMLO1基因全长4 019 bp,包含15个外显子，其中CDS序列长为1 707 bp,编码568个氨基酸。ProtParam预测显示，McMLO1蛋白的分子质量为65.40 ku,理论等电点为9.36,属不稳定亲水蛋白，主要位于细胞膜上；McMLO1蛋白包含一个由477个氨基酸组成的MLO保守结构域，其二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。氨基酸多重序列比对和系统进化分析表明，McMLO1与黄瓜MLO蛋白的同源性较高。qRT-PCR检测结果发现，McMLO1在叶片中的表达量显著高于根、茎、果实等组织。白粉病接种后，McMLO1基因的表达量显著提高，并在6 h达到峰值，推测该基因参与了苦瓜对白粉病侵染的早期应答反应。

【目的】Lon1蛋白酶具有降解叶绿体和线粒体内氧化蛋白、维持细胞正常代谢的功能。在分析蓝莓VcLon1时空表达模式的基础上,利用烟草遗传转化技术结合干旱生理分析,揭示蓝莓VcLon1的生物学功能,为运用生物技术培育蓝莓抗旱品种提供理论基础,并为其他植物抗旱机制研究提供基础信息。【方法】在从南高丛蓝莓‘夏普蓝’中克隆得到VcLon1全长(Gen Bank登录号:MF972079)的基础上,利用DNAMAN、MEGA4.0、Wo LF PSORT和Protparam等生物信息学软件及在线程序预测VcLon1序列及蛋白结构特征,分析比对氨基酸序列同源性并构建其同源蛋白序列进化树;同时,采用实时荧光定量PCR分析蓝莓VcLon1在不同组织及干旱条件下的表达模式;最后,构建表达载体,遗传转化本氏烟,以野生型、VcLon1超表达这2种基因型本氏烟为材料,进行干旱处理并分析二者在生物量生长、光合生理及氧化胁迫水平等方面的差异。【结果】1)PCR扩增得到VcLon1的ORF序列长2 982 bp,该序列编码993个氨基酸,预测蛋白的理论等电点为5.44,分子量为109.5 kDa。VcLon1编码的蛋白序列含有1个典型的AAA+结构域,属于AAA+超家族,定位分析编码蛋白在叶绿体和线粒体中表达,该蛋白与葡萄、苹果等Lon1蛋白酶亲缘关系较近。2)利用实时荧光定量PCR对VcLon1的表达量分析,发现其在‘夏普蓝’蓝莓各组织中均有表达,老叶中的表达量显著低于嫩叶,干旱胁迫显著提高蓝莓VcLon1的转录水平。3)干旱胁迫下各株系本氏烟生长均受到抑制,但VcLon1超表达植株均较野生型生长健壮,其中又以VL-6长势最佳,其叶片未发黄且根系发达,其株高、干质量分别比野生型高36.66%、114.29%。4)干旱胁迫下野生型本氏烟叶绿体肿胀明显且部分基粒片层结构模糊,分层不明显,而VcLon1超表达本氏烟仅部分叶绿体基粒片层空隙增大,其叶绿体超微结构未出现明显损伤,且叶片叶绿素含量高于野生型。同时,野生型本氏烟胞内线粒体普遍出现肿胀、变形,嵴断裂、解体并空泡化的现象,而VcLon1超表达本氏烟的线粒体仍维持正常椭球形。5)在氧化胁迫水平方面,VcLon1超表达植株干旱胁迫下的MDA含量均比野生型低34.38%~49.68%,且其叶片中H2O2的积累也较低,而野生型叶片的褐色面积明显上升。羰基化蛋白含量也呈现相似的变化趋势,VcLon1超表达本氏烟比相同条件下的野生型低36.89%,这可能由于VcLon1超表达植株各株系中SOD、GR、APX及POD等抗氧化酶的活性普遍显著高于野生型所致。【结论】干旱胁迫下,南高丛蓝莓‘夏普蓝’内VcLon1的运作机制可能是通过维护细胞膜系统及叶绿体的正常形态结构,同时通过降解线粒体内羰基化蛋白质,使线粒体结构保持完整、能量代谢等功能得以正常维护,减少活性氧自由基(ROS)的产生及维护抗氧化酶类活性,从而有效地降低细胞器内ROS的产生与积聚,并最终降低胞内的氧化胁迫水平,维持正常植物代谢,提高其抗旱能力。

马铃薯是世界性粮蔬作物。致病疫霉引起的晚疫病则是马铃薯育种所面临的最严峻问题之一,因此,分离和利用马铃薯晚疫病抗性基因获得抗病新品种是马铃薯育种的重要目标。首先在连翘中发现的一类与木质素合成相关的Dirigent基因可能在植物抗病虫害过程中起重要作用。试验根据马铃薯的EST序列信息设计特异性引物,并通过RT-PCR和RACE技术获得了一条全长为729 bp的Dirigent基因cDNA序列,命名为StDIR1;该cDNA编码一个包含191个氨基酸的蛋白质多肽;系统进化分析表明,该多肽是一种Dirigent-like蛋白,属于DIR-b亚群,与陆地棉Di-rigent-like protein ...

[目的]本文旨在探究BcCPR1基因对灰霉菌的抗性及对霜霉菌和非生物胁迫的响应。[方法]采用同源克隆方法从不结球白菜中克隆BcCPR1基因CDS序列;利用MEGA 7软件对其进行同源性分析;利用农杆菌介导法在烟草中进行亚细胞定位研究及转基因拟南芥植株的获取;利用RT-qPCR技术,对BcCPR1基因在生物及非生物胁迫处理下的表达水平进行分析。[结果]BcCPR1基因含有1个1 221 bp的开放阅读框(ORF),编码406个氨基酸,与同属的甘蓝和芜菁进化关系最相近,分别为97.54%和92.66%。亚细胞定位结果显示,BcCPR1蛋白定位在细胞膜上。霜霉菌、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和盐处理BcCPR1基因均有响应,并存在时间表达差异。过表达BcCPR1基因的转基因拟南芥对灰霉菌抗性增强,同时茉莉酸(JA)途径标记基因PDF1.2表达量显著上升。[结论]BcCPR1蛋白定位于细胞膜,主要通过茉莉酸(JA)途径调节过表达拟南芥对灰霉菌的抗性,对霜霉菌及非生物胁迫均有响应。

为明确miRNA沉默靶基因的调控机理,克隆AGO1蛋白基因并了解其作为沉默复合物核心成员在miRNA沉默通路中的作用,本研究在分析‘金冠’苹果基因组的基础上,以‘金冠’叶片cDNA为模板,克隆获得了3 234bp AGO1基因全长,蛋白分子质量为119ku,等电点为9.41,包含2个保守的AGO蛋白特征结构域:PAZ和Piwi区,命名为MdAGO1。苹果‘金冠’不同组织MdAGO1基因及13种与发育相关miRNA实时定量PCR分析结果表明:1)MdAGO1在花和果实中表达量均高于叶片;2)miRNA在果实和花中表达量均较高,叶片相对较低。MdAGO1与13种发育相关miRNA表达一致,在苹果中...

SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)在拟南芥中被证实为调节花芽发育的关键因子。胡桃楸是一种重要的木本油料果材兼用树种，其雌雄异型异熟的开花特性未知。为探索SOC1基因在胡桃楸雌雄异型花芽发育过程的调控作用及促进早花的分子机制，利用胡桃楸花芽转录组数据获取SOC1基因CDS序列，通过PCR扩增技术克隆出SOC1基因的cDNA序列全长，并对其进行生物学信息分析；同时，利用qRT-PCR方法对SOC1基因在胡桃楸不同器官组织以及雌雄先型雌雄花芽不同发育时期的表达情况进行定量分析。结果表明：胡桃楸成花相关JmSOC1基因cDNA序列全长为705 bp，编码234个氨基酸；生物信息学分析得出JmSOC1蛋白分子量为21 569.04 Da；理论等电点（pI）值为8.3。qRT-PCR定量表达分析显示，JmSOC1基因在雌雄花蕾、果实、叶和茎中均有表达，但在雌雄花芽中表达量较高，且在雌花中表达量最高；并且在生理分化期时的雌雄花芽表达量趋于平稳，而到形态分化期时雌雄花芽表达量呈递增趋势，且表达量明显高于生理分化期。因此，推测JmSOC1基因参与了胡桃楸雌雄花芽发育的全过程，在开花过程中起着重要的调控作用。研究结果为进一步探索胡桃楸花芽发育的分子机制奠定了基础。

为研究草莓中ＳＣＦ复合体的功能，以栽培草莓品种‘７４’为试材，采用同源克隆的方法分离出２个ＳＫＰ１基因。这２个基因核苷酸序列全长均为５１９ｂＰ，核苷酸序列相似性为９８．４６％，氨基酸序列相似性为９８．８４％，并具有特殊的‘ＧＶＤＥＤ’尾巴结构，分别命名为ＦａＳＫＰ１－１ａ和ＦａＳＫＰ１－１ｂ（基因登录号分别为ＫＵ９７５０５７和ＫＵ９７５０５８）。ＲＴ－ＰＣＲ和ＤＣａＰＳ分析发现ＦａＳＫＰ１－１ａ和ＦａＳＫＰ１－１ｂ在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达，在花瓣中表达量低。上述结果表明ＦａＳＫＰ１－１可能在草莓ＳＣＦ复合体的形成过程中发挥重要作用。

为了提高甘薯的抗逆能力,通过RACE的方法克隆到一个含有AP2结构域的ERF家族基因,该家族基因在植物逆境调控中起重要作用。该基因c DNA全长1 025 bp,编码区为669 bp,编码223个氨基酸,该基因在甘薯中未曾报道,将其命名为Ib ERF3。通过进化树分析发现,Ib ERF3在茄目类作物中具有一定的保守性。通过定量PCR研究发现,Ib ERF3在甘薯根、叶中都有表达,且在叶片中的表达量最高,同时研究发现,在干旱、盐胁迫处理后Ib ERF3在根和叶片中表达量都显著上升。在用植物激素ABA处理后,Ib ERF3的表达量逐渐上升并在24 h时达到最大。因此,推测Ib ERF3在甘薯抗逆途...