从辽宁省沈阳市和盖州市分别采集表现花叶的南瓜样品,经透射电镜负染色实验,观察到典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)线状病毒粒子.利用Potyvirus通用引物Legpoty F/LegpotyR分别对3个沈阳样品和3个盖州样品进行RT-PCR扩增,得到预期片段,克隆并测序.Blast显示6个病毒样本与小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)同源性最高,均大于99%.利用已经报道的特异引物ZYMV-F/ZYMV-R,从6个样本中扩增到约1.2 kb的ZYMV片段,片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因.基于CP的核

采集河南省驻马店市13个不同田块小麦样品,利用RT-PCR、ELISA和Western Blotting检测技术进行检测,结果表明,该地有小麦黄花叶病毒的存在与分布。对检测为阳性的一个分离物全序列进行cDNA克隆和测序,与已报道WYMV河南潢川、江苏扬州、四川雅安和日本分离物的全序列进行比对,RNA1核苷酸一致性为97.1%~98.4%;RNA2为95.1%~98.4%;氨基酸一致性分别为94.8%~97.8%和94.2%~98.2%。利用软件MEGA4.1对上述五个RNA1和RNA2的全序列分别进行进化树分析,结果表明,驻马店分离物与潢川亲缘关系最近,而与四川雅安亲缘关系最远。

对长沙地区160份南瓜疑似病毒病样品进行小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)检测,检出率达46.9%。为进一步明确长沙地区ZYMV分离物的分类地位和分子进化特征,克隆获得了1个长沙地区ZYMV外壳蛋白基因,与Gen Bank已报道的ZYMV外壳蛋白基因比对,并进行基因重组、系统发生、遗传差异、选择压力、种群结构和基因漂流分析。结果显示:长沙地区ZYMV外壳蛋白基因没有发生明显的重组,突变与负选择作用是其进化的主要驱动力,种群结构相对稳定,但正处于扩张的趋

通过RT PCR,获得了小麦黄花叶病毒罗田分离物28kD蛋白基因的cDNA克隆pUW28 10。序列分析结果表明,小麦黄花叶病毒不同分离物的28kD蛋白基因的核苷酸序列存在一定的差异:湖北罗田和河南潢川分离物在第326,327和336位较四川雅安、江苏扬州及日本分离物缺少3个核苷酸(nt),前两者核苷酸长度为762nt,后三者为765nt;不同分离物核苷酸序列同源性从92 1%到96 9%,相应的氨基酸序列同源性从89 8%到97 3%。

采用已报道的菜豆金色花叶病毒属的通用引物ＰＡ／ＰＢ，从辽宁葫芦岛地区的３份番茄样品中扩增到Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ的保守区域，获得３个长度约５００ ＢＰ的克隆序列，同源性为９９．５８％．ＤＮＡ－Ａ全基因组序列分析结果显示，３份样品ＤＮＡ－Ａ全长均为２ ７８１ ＢＰ（分别命名为ＬＮｈｕＤ１、ＬＮｈｕＤ２和ＬＮｈｕＤ３分离物），具有典型双生病毒结构，与番茄黄化曲叶病毒（ＴＹＬＣｖ）山东分离物（ＴＹＬＣｖ－［ＣＮ：ｓＤ：ｓＤＷＦ－Ｌ７：１２］，ＫＣ９９９８５０）的核苷酸同源性最高（９９．６％）．根据双生病毒分类标准，认为ＬＮｈｕＤ１、ＬＮｈｕＤ２和ＬＮｈｕＤ３是ＴＹＬＣｖ的辽宁分离物．系统关系树表．．．

【目的】小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE(10 mmol·L~(-1) Tris-HCl和1 mmol·L~(-1) EDTA)缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施的方法施用dsRNA,设计先喷施dsRNA后接种病毒的预防试验和先接种病毒后喷施dsRNA的治疗试验,通过统计分析接种病毒后21 d发病率的方法评价dsRNA预防和治疗ZYMV的效果。【结果】针对ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段以及GUS基因片段建立了能够高效稳定表达和释放dsRNA的生产体系。在IPTG诱导浓度为8 mmol·L~(-1),诱导时间为7 h,在宁波新芝牌超声波细胞破碎仪3?的档位和60%的输出功率条件下破碎15 min,细胞可以有效产生和释放dsRNA。在对ZYMV的预防试验中发现,喷施GUS基因片段的dsRNA以及TE缓冲液的西瓜植株发病率均为100%的情况下,对ZYMV防治效果最好的是HC-Pro基因片段,接种ZYMV 21 d后防治效果可达到95%,防治效果相对较差的是NIb基因片段,但也可达到80%。在此基础上对HC-Pro片段预防和治疗ZYMV的效果进行了深入分析,结果发现在喷施HC-Pro片段的dsRNA后第3、5、7天接种ZYMV,植株发病率分别为16%、63%、63%,在接种ZYMV后第1、3、5、7天分别喷施HC-Pro片段的dsRNA,无明显的治疗效果,仅起到延迟植株发病的效果。【结论】建立了针对ZYMV不同基因片段的dsRNA原核表达体系,并发现基于HC-Pro基因片段产生的dsRNA对ZYMV防治效果最好,可显著降低植株的发病率、延迟植株发病时间,具有应用潜力。

【目的】研究BaMV福州分离物BaMV-TMS1及其携带的卫星RNA(satBaMV)分离物satBaMV-TMS1的全基因组特征,明确其系统发育关系;对BaMV进行c DNA侵染性克隆构建方法的改进,为其反向遗传学体系的快速建立提供简便的方法。【方法】根据已报道的BaMV和satBaMV全长序列保守区分别设计2对和1对扩增引物,从感染BaMV的竹叶中扩增、克隆获得BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1的全长序列,并进行序列特征分析和系统发育树构建。采用多片段无缝克隆方法将扩增得到的2个病毒DNA片

从我国北方地区呈现花叶症状的白草上分离得到1个白草花叶病毒分离物(AY642590,PenMV-B),测定了其RNA的核苷酸全序列。结果发现,该病毒分离物的RNA基因组全长共9 611个核苷酸,5′-末端和3′-末端的非翻译区序列分别为172和241个核苷酸,中间为9 198个核苷酸的开放读框,编码3 065个氨基酸,分子量约为349 575 Da;其多聚蛋白P3/6K1处的E/H蛋白切割位点序列与Potyvirus属其他病毒均不相同,为该病毒所仅有。预期的Potyvirus属病毒的一些重要的、功能性保守基序特征都存在于该病毒的基因组序列中。Potyvirus属病毒多聚蛋白氨基酸序列的系统进化...

采用鉴别寄主、血清学及ＲＴ－ＰＣＲ检测的方法对采自辽宁省葫芦岛地区的辣椒病毒进行了分离与鉴定，并将克隆得到的病毒ＣＰ基因进行测序及同源性比较。结果表明：该病毒分离物可侵染辣椒（ＣａＰｓｉＣｕｍ ｆＲｕＴｅｓＣｅｎｓ）产生局部枯斑、系统斑驳或花叶；局部侵染普通烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ＴａｂａＣｕｍ）、心叶烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ｇｌｕＴｉｎｏｓａ）、三生烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ＴａｂａＣｕｍ．ｖａＲ．ｓａｍｓｕｎ）、矮牵牛（ＰｅＴｕｎｉａ ｈｙｂＲｉｄａ）产生坏死枯斑，在曼陀罗（ｄａＴｕＲａ ｓＴＲａｍｏｎｉｕｍ）、洋酸浆（Ｐｈｙｓａｌｉｓ ＰｕｂｅｓＣｅｎｓ）和苋色藜（ＣｈｅｎｏＰｏｄｉｕｍ ．．．

从云南省弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝，植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ（Ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ），在红花大金元品种中以ＴＭＶ普通株作对照进行致病力测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒ＲＮＡ云南强毒株系为模板，根据国内外研究结果自行设计、合成寡核苷酸引物，通过ＲＴ—ＰＣＲ体外扩增，Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α克隆，获得了云南烟草５４ＫＤ（ＴＭＶ复制酶）全基因片段。顺序分析表明：该基因含１４２５个核苷酸，编码４７５个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，ＤＮＡ同源率为９９．０％，氨基酸同源率为９８．９％，与国内普通株比较，ＤＮＡ同源率为９９．１％，氨基酸同源率为９８．９％。

从云南弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ；在烤烟品种红花大金元上以ＴＭＶ普通株作对照进行致病率测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒（ＴＭＶ）云南强毒株系ＲＮＡ为模板，根据国外研究结果，自行设计、合成寡核苷酸为引物，通过ＰＴ－ＰＣＲ体外扩增，得到约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段，将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α上，并进行了序列分析。分析表明，该其因含４７７个核苷酸，编码１５９个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，核苷酸同源率为９８．１％，氨基酸同源率为９７．５％。获得了云南烟草ＴＭＶ外壳蛋白全基因片段。

【目的】对一批荷兰进境番红花种球(Crocus sativus)进行病毒鉴定,以防止危险性病毒传入危害。【方法】根据已报道的马铃薯Y病毒科(Potyviridae)通用引物(Sprimer和M4T),采用RT-PCR方法对一批番红花种球样品进行检测,取其中一个RT-PCR产物进行克隆测序,利用Gen Bank上的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)和MEGA 6中的基于对数期望的多重序列比较(Multiple Sequence Compar

【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一，严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性，为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样，提取总RNA，利用TMGMV特异检测引物确认阳性后，设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列，通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上，获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性，利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒，经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果，测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt，编码4个功能蛋白，分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白CP。同源性分析结果显示TMGMV-JS与重庆分离物TMGMV-TN29(MF139550)同源性最高，厦门分离物（JX534224）次之，系统进化分析结果也显示TMGMV-JS与其他TMGMV聚于同一大分支，其中与重庆、厦门两个分离物在同一小分支，相对近缘。构建的pCB301-TMGMV-JS侵染性克隆载体可以系统侵染本氏烟，引起叶片黄化，植株系统性坏死；也可以系统侵染辣椒，引起叶片斑驳、卷曲和植株矮化等症状。【结论】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV-JS分离物基因组全长6 356 nt，与国内重庆、厦门TMGMV分离物具有较近的亲缘关系，同属于一个分支；构建的TMGMV-JS侵染性克隆可以系统侵染本氏烟和辣椒，在本氏烟上会导致系统性坏死。

为从分子水平鉴定山东聊城的一表现明显花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜病毒病的病原。采用RT-PCR的方法,用TMV外壳蛋白(CP)基因的特异引物,对该样品进行了检测,克隆到的基因序列进行分析,并使其在大肠杆菌中表达。结果表明,从该样品中扩增到了TMV的CP基因,说明该样品受到TMV的侵染,首次发现TMV自然侵染南瓜。对CP基因序列测定及分析表明,与GenBank上其他TMV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为86.5%～99.0%,推导的氨基酸序列同源性为93.7%～99.4%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:32个TMV分离物可分为5个组,其中TMV-liaocheng与Nak...

为了检测和鉴定山东地区葫芦科蔬菜上病毒病种类，从山东诸地１１个蔬菜种植区采集了８６７个葫芦科蔬菜疑似感病样品。利用黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒、甜瓜黄斑病毒、瓜类褪绿黄化病毒、李属坏死环斑病毒及甜瓜坏死斑点病毒等特异性引物对疑似感病样品分别进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，各病毒检出率分别为３４．８％，１０．４％，２０．０％，４１．７％，２７．０％，７．８％，２．６％，１．７％，０，０．９％。表明除ＰＮＲＳＶ外，其他９种病毒在山东各地均有发生，且ＣＭＶ和ＴＭＶ发病率较高，２种或２种以上病毒复合侵染也很普遍。同时为明确山东地区ＣＭＶ分离物的株．．．