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[期刊] 西南农业学报
[作者]
谭雅芹 闫慧清 姜山
【目的】为利用绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达情况优化聚乙二醇(PEG)介导的小立碗藓原生质体的转化体系及检测CAD1基因在细胞中的定位,构建小立碗藓GFP-CAD1-PTN182融合基因表达载体。【方法】用高保真酶获得GFP基因,通过双酶切GFP基因和CAD1-PTN182表达载体,将两片段洗脱回收,然后用T4-DNA连接酶将酶切产物在16℃条件下过夜连接。将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中,通过凝胶成像电泳的方法,挑选阳性克隆进行验证,并经过酶切验证和测序。【结果】序列对比相似度达10
关键词：
GFP 高保真酶 载体构建 基因克隆
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈波 闫慧清 李莉 曹海鹏 辛健康 姜山
【目的】为探明PpCASLUU3是否参与灰霉菌引起的小立碗藓中类过敏反应,构建PpCASLUU3-PTN182敲除载体,对早期登陆植物防卫防御的进化提供依据。【方法】根据同源重组的原理,以小立碗藓基因组DNA为模板,利用Primer 5设计的引物,扩增得到小立碗藓PpCASLUU3基因的上、下游同源臂基因片段。将上下游同源臂基因分别克隆到pMD-19T上,测序验证,使用EcoR I、EcoR V酶切含上游目的基因的pMD-19T获得上游目的基因片段,使用BamH I、Sma I酶切含下游目的基因的pMD-19T获得下游目的基因片段,同时酶切PTN182载体,经T_4-DNA连接酶连接,转入大肠杆菌感受态,筛选出阳性克隆,采用相同的方法,将下游臂连入PpCASLUU3.1-PTN182载体。【结果】经PCR检测、酶切验证,获得了完整的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除载体。经测序分析,插入序列PpCASLUU3.1和PpCASLUU3.2与未插入前相似度分别为100%和99.63%。【结论】PpCASLUU3-PTN182敲除载体构建成功。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
魏雪涛 李银 鲍恩东
根据已发表的马立克氏病病毒(MDV)血清I型与鸡白介素2(IL2)DNA序列,设计两对引物,用PCR扩增出MDVgB基因和IL2基因,并克隆入pEGFPC1载体,构建了载体pC1gBIL。通过酶切分离外源基因表达盒,并将外源基因表达盒插入pTK2B质粒,成功构建了转移载体pTCgBIL。将转移载体pTCgBIL转染CEF细胞,培养36～48h后,经荧光显微镜观察,有荧光出现,证明该载体得到表达,并通过Westernblotting鉴定证明MDVgB和IL2的融合基因得到了有效的表达。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
徐荣 吴清莲 孟玉 陈疏影 王先宏 何丽莲 李富生
【目的】本研究旨在构建适合甘蔗遗传转化的双基因表达载体,用于提高甘蔗栽培品种的抗旱能力,并探讨基因表达规律及互作效应。【方法】本研究以前期课题组在割手密中克隆到的具有抗旱功能ScNAC1和ScDREB为目的基因,以对单子叶植物高效、专一的Ubiquitin为启动子,以适于单子叶植物遗传转化的表达载体pCAMBIA1300-nu为基础载体,利用改造后的FMDV2A多肽进行连接,采用重叠延伸PCR(简称SOE PCR)将ScNAC1和ScDREB基因相融合,利用同源重组的方法连接表达载体。【结果】经PCR验证获得约2000 bp的目的条带,利用BamH I与Sac I双酶切,切出了载体的1条大片段和连接目的基因的3条小片段,测序结果验证扩增产物的正确性,融合基因在扩增过程中无突变发生。【结论】本研究成功构建了符合需要的融合基因表达载体,为后期甘蔗的遗传转化研究奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵传志 苏磊 李爱芹 夏晗 李长生 王兴军
克隆大豆油体蛋白特异启动子及油体蛋白基因的全长序列,利用连接PCR的方法,通过一个肠肽酶位点将人成骨蛋白成熟肽编码序列连接到油体蛋白基因3’端并克隆到表达载体pCAMB IA1302中,构建"油体蛋白-肠肽酶-人成骨蛋白"植物表达载体。通过酶切、PCR和测序鉴定,证明表达载体构建成功,将其命名为pCAM-oleo-Bmp7。通过蛋白分析软件DNAstar、S ignalP3.0和ProtComp v8.0等软件对重组蛋白的理化性质、二级结构、信号肽和细胞定位进行了分析和预测,证明融合蛋白很好的保留了原来两个蛋白的二级结构和理化性质。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
周丽英 李虎 丁玉梅 卜璐璐 侯思明 许俊强 张应华 杨正安
以四季耐抽薹生菜为材料，ＰＣＲ扩增并克隆了生菜质体ＲＰｏ Ａ基因的两侧翼的基因片段，利用该两基因区段作为定点整合外源基因的同源重组片段，构建了生菜质体定点转化载体Ｐ ＢＲＰｏ Ａ－ＧＦＰ，并进行了原核表达分析。结果表明，ＰＣＲ所扩增的两条基因区段大小为１．２与１．１ ｋＢ。进行序列分析后，经酶切、连接和转化，构建成含ＰＲＲｎ－ＧＦＰ－ＡＡｄ Ａ－ＴＰｓＢ Ａ表达盒的质体表达载体，酶切鉴定表明，所构建载体符合预期设计；ＧＦＰ基因能够在质体特异性启动子ＰＲＲｎ及终止子ＴＰｓＢ Ａ的调控下高效表达，表达量约占总可溶性蛋白的４５．６％，包涵体占菌体蛋白的４７．５％，该载体的构建为后期生菜质体转化体系的．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
张煜星 崔燕 武寒雪 祝建波 周鹏
采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出Accase羧基转移酶-βCT亚基编码基因accD,Accase羧基转移酶-αCT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。分析结果与NCBI公布的氨基酸同源性分别为100%,99%。将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建了融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD,为下一步作物的遗传转化打下了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
那杰 王关林 夏然 杨怀义
【目的】建立研究草莓果实膜联蛋白基因annfaf功能体系。【方法】利用反义基因技术将从草莓成熟果实中分离克隆的annfaf基因定向克隆至植物中间表达载体pROKⅡ,构建了annfaf反义融合基因植物表达载体pRRJ4,通过根癌农杆菌EHA105将其导入草莓基因组。对获得的抗性植株进行PCR和Southern检测分析。【结果】表明该反义基因已整合到草莓基因组中。【结论】可进一步筛选annfaf基因表达缺陷型植株,用于探讨annfaf在非跃变型果实草莓成熟中的调控作用,为培育草莓新品种提供中间材料。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李根英 夏兰芹 夏先春 何中虎
【目的】构建Pina、Pinb融合基因表达载体,验证Pina和Pinb基因的功能,为利用转基因技术改良小麦籽粒质地提供理论依据和基础材料。【方法】以软质小麦京411作为Pina和Pinb基因的供体,将Pina、Pinb基因融合后,与基础质粒pG4AB上的Ω和poly(A)等增强基因表达的调控序列及pAHC25上的Ubiqutin启动子和bar基因表达盒相连接,构建Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体。利用基因枪转化硬粒小麦幼胚,并对硬粒小麦幼胚再生体系进行探索。【结果】在构建完成Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体pFUBPaPb的基础上,转化硬粒小麦幼胚16000多枚,经biol...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陆玉建 石东里 张兰 田莎 张韩杰 刘南南
在生物或非生物胁迫的条件下，小麦的产量和质量常会受到一定的影响。基因工程技术是小麦品质改良的有效手段，但目前小麦的转化效率还比较低。通过克隆大肠杆菌ｏｔｓ Ａ和ｏｔｓ Ｂ基因，将目的基因和ｐ２３００－ＧＦｐ相连，成功构建ｐ２３００－ｏｔｓ ＡＢ表达载体。以普通小麦品种为材料，在建立较完善再生体系的基础上，利用根癌农杆菌介导法进行转化，将ｏｔｓ ＡＢ导入到受体细胞，进而获得耐盐的转基因小麦新品种。遗传转化条件的优化结果表明，当农杆菌的ｏＤ６００＝０．５，侵染成熟胚或愈伤组织的时间为３０ ｍｉｎ，共培养时间为３ Ｄ，小麦的转化效率最高。结果可以为今后通过基因工程技术提高小麦的抗逆能力提供参考。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
饶雪琴 李华平
利用PCR重叠延伸技术(genesplicingbyoverlapextension,SOE)将番木瓜环斑病毒(Papayaring-spotvirus,PRSV)Vb株系的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因和Ys株系的复制酶(replicaseprotein,RP)基因构建成融合基因VY。同时对常规的SOE法进行了改进,并对改进的SOE的反应体系进行了优化,其中以Py-robestDNA聚合酶和60℃的退火温度为最佳。将融合基因VY构建在植物表达载体pCAMBIA2300上,测序结果表明,该融合基因的序列与设计相符。融合基因VY植物表达载体的构建,可为进一步获得对PRSV广谱抗性的...
关键词：
番木瓜 番木瓜环斑病毒 PCR 融合基因
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张立 王建锋 王晓杰 康振生 韩德俊
以小麦品种西农1376为受体,利用Overlapping PCR的方式构建了防御素基因alfAFP和抗菌肽基因spCEMA融合基因的表达载体,与pAHC20共转化幼胚愈伤组织,获得转基因再生T0代植株269株,春化后移栽成活188株。对叶片基因组DNA进行目的基因和bar基因PCR扩增表明其中7株是共整合植株,共整合频率为0.1%,初步证明融合基因已成功通过共转化方式导入受体小麦品种中。影响共整合率的因素分析表明,在使用除草剂PPT对bar基因进行筛选的过程中,筛选时间的缩短并不会明显降低筛选的效率。
关键词：
小麦 转基因 融合基因 共转化
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
朱海生 陈敏氡 温庆放
根据草莓psy、pds和zds基因序列,设计含有酶切位点的特异引物,以草莓总RNA为模板,通过RT-PCR法分别克隆psy、pds和zds基因.以植物表达载体pBI121为基础,利用口蹄疫病毒2A序列将psy、pds和zds基因融合在同一个开放阅读框下,构建成三价融合植物双元表达载体pBI2A2Apsy-pds-zds.同时构建了psy和zds基因二价融合植物表达载体pBI2A2Apsy-zds.经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后,成功将2个重组表达质粒pBI2A2Apsy-pds-zds和pBI2A2Apsy-zds导入农杆菌EHA105中.
关键词：
草莓 psy pds zds 表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
西廷业 王洪刚 后猛 刘海燕 刘树兵
以植物双元表达载体pCAMBIA2300-35为基础,设计带有酶切位点KpnI和XbaI的一对引物,从克隆载体pGEM-NCED1扩增到目的基因TaNCED1,酶切回收后与同样双酶切的表达载体pCAMBIA2300-35连接,获得表达载体pTaNCED1,并将所构建的载体导入根癌农杆菌GV3101菌株,为该基因的功能鉴定及通过基因工程的方法提高小麦的抗逆性奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曾国航 徐宏伟 李莲瑞
【目的】构建新疆多浪羊ＩＬ－１β基因编码区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行诱导表达，为进一步研究ＩＬ－１β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒ｐＭＤ－１８Ｔ－ＩＬ－１β的大肠杆菌ＤＨ５α中获取ＩＬ－１β基因，与ｐＥＴ－２８ｂ质粒ＤＮＡ连接，构建原核表达载体ｐＥＴ－２８ｂ－ＩＬ－１β。先将其转化到克隆载体Ｅ．ｃｏＬＩ ＤＨ５α感受态细胞中大量拷贝，经菌液ｐｃＲ和ＥｃｏＲⅠ、ＸＨｏⅠ双酶切鉴定后，提取ｐＥＴ－２８ｂ－ＩＬ－１β质粒转化到表达载体Ｅ．ｃｏＬＩ ｂＬ２１（ＤＥ３）中，再次进行菌液ｐｃＲ和ＥｃｏＲⅠ、ＸＨｏⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于Ｌｂ液体培养基，以终浓度为１ＭＭｏＬ／Ｌ Ｉｐ．．．
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多浪羊 IL-1β基因 原核表达
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