通过三亲本杂交,分别将紫云英根瘤菌7635R的基因文库和慢生型大豆根瘤菌22-10的基因文库引入到慢生型大豆根瘤菌22-10中,获得了大量的含有外源DNA片段的转移接合子。以结瘤试验作选择标准,从中筛选到3株具有较高固氮效率的基因工程菌株HN5-1、HN5-2和HN22-2。采用反向杂交,将接合子HN5-2中的外源重组质粒转回到大肠杆菌中,提取质粒作EcoRI酶切。表明pLAFR1质粒载体上携带有大约20 kb大小的DNA片段。实验还证明,在含有从根瘤菌转移而来的pLAFR1质粒的大肠杆菌细胞中,常伴随有辅助性质粒pRK2013的存在,用四环素和卡那霉素两种选择性抗性可淘汰其中的pRK2013...

以柯斯质粒ｐＬＡＦＲ１为载体先构建快生型花生根瘤菌８５－７菌株总ＤＮＡ的基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３帮助下用此基因文库分别同菌株８５－７和另一株慢生型花生根瘤菌菌株Ｃ０２－５作三亲本杂交。转移接合子接种沙培条件下生长的花生，通过结瘤试验初筛选和复筛选，共筛选出３株工程菌ＨＮ１１、ＨＮ１２（以８５－７为受体）和ＨＮ１３（以Ｃ０２－５为受体）。其每植株根瘤的固氮酶活分别比出发菌株的提高３０２％（ＨＮ１１）、３５６％（ＨＮ１２）和２８４％（ＨＮ１３）；每植株干重分别比出发菌株的提高８５％（ＨＮ１１）、８３％（ＨＮ１２）和２８％（ＨＮ１３）。工程菌株的重组质粒酶切分析表明，除载体ｐＬＡＦＲ１外还...

【目的】大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）是微生物肥料重要的功能菌种之一，可通过生物固氮为大豆生长提供氮素，实现节本增效，菌株5873作为其典型代表，已广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异引物，建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速检测方法，对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要。【方法】以商业化菌株大豆根瘤菌5873为供试材料，基于其全基因组序列和NCBI数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列，以及与其高度同源（基因组ANI值大于99.95%）的大豆根瘤菌USDA 6T差异片段，通过多重序列比对，进行特异引物设计和筛选，获得特异性引物对，并通过对PCR反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测，建立大豆根瘤菌5873的快速检测方法。然后，采用盆栽试验，将大豆根瘤菌5873与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际，应用上述方法对大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力进行评价和方法验证。【结果】筛选获得了一组特异引物4-4和Q1(4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′)，优化并建立了PCR快速检测方法，即反应体系：Premix Taq~(TM) 12.5μL，引物各1.0μL，基因组DNA 15 ng左右，加ddH2O补足至25μL；反应条件：95℃预热5 min,94℃变性45 s,61℃退火45 s,72℃延伸60 s,30个循环，再72℃延伸10 min。通过凝胶电泳检测目的条带的有无（355和218 bp），即可实现大豆根瘤菌5873的快速检测，该方法检出灵敏度为1 850 CFU/μL。此外，借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力，与传统BOX-PCR评价结果一致。【结论】大豆根瘤菌5873快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板，直接进行PCR扩增的鉴定操作，省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA提取及测序鉴定等繁琐的环节，大大减少了工作量，只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌5873，为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考。

采用Southern转移,放射性同位素分子杂交等研究手段,对本课题组构建的一株高效固氮大豆根瘤菌HN32中的外源片段的来源进行了分析。研究结果证实:该外源片段确系来源于Sinorhizobium fredii B52菌株,并且在受体Bradyrhizobium japonicum 22—10菌株中本不存在。

采用盆栽结瘤实验法对从 6省市采集的 18份土样中分离的 16 0株大豆根瘤菌进行了结瘤与共生固氮效率的比较测定 ,从中筛选出固氮效率较高的菌株ZX2 0和SMH12。通过测定 2株菌的竞争结瘤能力 ,确认其可以进入小区田间试验。

在盆栽条件下,对加拿大豌豆品种M.P.1824接种8株豌豆根瘤菌菌株,研究其对豌豆生育特征、产量及品质的影响。结果显示:与不接种对照相比,接种根瘤菌可以延长豌豆生育期,促进后期豌豆植株生长,提高产量,增加籽粒粗蛋白质、粗纤维含量,以及降低可溶性糖含量。其中,接种菌株ACCC 16058豌豆初花期、盛花初荚期、盛荚期及成熟期分别推迟3.1、5.2、4.8及12d,盛花初荚期分枝数增加45.5%,成熟期株高增加16.61%,单株荚数、单株粒数、单株籽粒干重及单盆籽粒干重分别提高76.67%、85.54%、65.13%和36.71%,均存在显著差异(P<0.05)。接种商用菌株F98,可显著提高籽粒...

以大豆快生根瘤菌HH103中glnK同源基因SfHH103_03182为研究对象,采用pK19mob单插入失活技术构建该基因的插入失活突变体,菌落PCR和测序分析表明突变体构建正确。植物盆栽试验结果显示,与接种野生型菌株HH103相比,突变体接种植株的根瘤数量增多,植株鲜质量和根瘤鲜质量增加,根瘤固氮酶活无显著差异。在不同浓度氮素处理和盆栽条件下,对共生表型的检测表明突变体接种植物的根瘤数量没有显著变化。

对紫云英根瘤菌７６５３Ｒ基因文库的５个重组质粒，即ｐＮＲ１０２，ｐＮＲ１０３，ｐＮＲ１０８，ｐＮＲ２０３，ｐＮＲ２１３进行各种内切酶的酶切分析。结果证实它们均含有１．７ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－Ｂｇ１Ⅱ双酶切片段和１．９ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＳａｃⅠ双酶切片段，而ｐＮＲ２１３的外源片段最大，包含有其余质粒所具有的各种片段。以ｐＮＲ１０８的外源片段作探针，进行ＤＩＧ杂交，发现探针与其余４个重组质粒的外源片段有强的同源杂交；与７６５３Ｒ的内源质粒杂交还表明，ｐＮＲ１０８的外源片段来源于共生质粒ｐＲａ７－２。

对分离自海南尖峰岭自然保护区木本豆科植物的2个根瘤菌菌株RIF200835和RIF200845进行了鉴定。这两个菌株的16S r DNA序列同模式菌株Rhizobium miluonense CCUAU 41251T的相似度分别为98.28%和98.51%。对这两个菌株进行全细胞脂肪酸组分和全细胞醌组分的分析结果表明,菌株RIF200835和RIF200845在组分上与模式菌株较为一致,但在含量上稍有差异。RIF200835和RIF200845这两个菌株的DNA G+C mol%含量分别为63.68%和60.56%,介于根瘤菌G+Cmol%含量范围(57%65%)之内。这两个菌株的看家基因at...

从数值分类获得苜蓿、草木樨和锦鸡儿根瘤菌的 3个新群。本实验对这 3个新群内菌株及部分已知种参比菌株进行了 DNA- DNA杂交分析和 G+Cmol%测定。结果表明 :三群中心菌株 XJ96 0 6 0 ,XJ96 4 0 8,NM0 19与其相应群内菌株的 DNA同源性分别为 71.7%～ 97.6 % ,80 .8%～ 98.7% ,82 .7%～ 86 .9% ,均大于 70 % ;各群的 ΔTm 值分别为 3.2℃ ,2 .8℃ ,2 .6℃ ,均小于 5℃ ;与各已知种的 DNA同源性分别为 0～4 1.7% ,0～ 39.3% ,4 .0 %～ 4 4 .7% ,均低于 70 % ...

为了进一步研究发掘新的根瘤菌资源库,采用平板划线分离的方法从大豆根瘤中分离纯化根瘤菌,并且将获得的菌株进行盆栽回接试验,结果表明,分离获得的大豆根瘤菌菌株均可在大豆和苜蓿上结瘤,具有结瘤能力。根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nod A、nif H、16S r DNA保守区域设计引物,并且对nod A、nif H、16S r DNA序列进行扩增分析和系统发育分析,由此鉴定分离的根瘤菌为费式中华根瘤菌,从而在分子水平上实现了对大豆根瘤菌的快速鉴定。

以自东北地区分离的 8株大豆慢生根瘤菌为供试菌用交叉凝集反应比较了它们与目前国内外已报道的 15株大豆慢生根瘤菌标准血清型菌株之间的血清学关系。研究结果表明 :(1)菌株 93H10F5和HJ15不与供试标准血清型菌株发生交叉凝集反应 ,分别命名为O14 和O15血清型。 (2 )菌株HJ19、HJ2 8、93F42与标准血清型菌株USDA94有交叉凝集反应 ,进一步的抗原吸收试验结果表明 :HJ19和HJ2 8的抗原组成完全相同 ,命名为O3bcd血清亚型 ;USDA94仅与HJ19有交叉反应 ,命名为O3ab血清亚型 ;93F42也与HJ19有部分共同抗原 ,命名为O3de血清亚型。 (3...

将碗豆根瘤菌共生质粒ｐＪＢ５ＪＩ导入紫云英根瘤菌７６５３Ｒ及其消除了共生质粒的突变株７６５３Ｒ＋１。两种类型转移接合子在人工合成培养基上繁殖时，ｐＪＢ５ＪＩ能稳定存在，但从它们在碗豆或紫云英上所结根瘤的分离物中，只有部分检测到ｐＪＢ５ＪＩ。以转座子Ｔｎ５及首蓿根瘤菌ｎｏｄ基因为探针，对未检测到ｐＪＢ５ＪＩ质粒的根瘤分离物７６５３ＲＡ９及７６５３Ｒ＋１Ｐａ，进行ＤＮＡ同源性分析，结果表明ｐＪＢ５ＪＩ质粒并没有全部丢失，很可能全部或部分整合到了受体紫云英根瘤菌的染色体中。

【目的】分析根瘤菌基因组中的简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs),为其在根瘤菌遗传多样性研究中的应用提供有益的信息。【方法】利用公共的微生物串联重复序列数据库资源,对已测序的3种根瘤菌基因组中SSRs的结构类型、分布、丰度等进行系统的比较分析。【结果】大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)基因组中的SSRs分别为1410个、859个和638个,3种根瘤菌基因组中长重复的四、五、六核苷酸基序更为丰富,变异性更高。数目...

应用特定根瘤菌株接种豆科植物与土著根瘤菌竞争结瘤,在竞争中特定根瘤菌结瘤数占总瘤数的百分数称为占瘤率。这是分析特定根瘤菌株产生增产效果的重要因素。测定占瘤率的方法,主要有抗性标记技术,荧光抗体技术,酶连免疫技术,分子杂交技术和红外线指纹图谱法等,每种方法都有其优缺点。本研究利用HN32菌株的四环素抗性测定技术和α—~(32)P标记的pHN32为探针进行的DNA/DNA杂交技术来考查田间接种大豆根瘤菌工程菌株HN32的占瘤率。