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[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
潘琛 任百光 盖颖
木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ＣＣＲ）是在木质素合成过程中，催化苯丙烷类合成途径第１步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶Ａ酯为例，以现有的辅酶Ａ酯合成纯化的文献报道为参考，介绍经过整合改进并不断试验而得到的ＣＣＲ底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶４－香豆酸辅酶Ａ连接酶（４ＣＬ）用于合成ＣＣＲ底物，这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的４ＣＬ可以在－８０℃下保存３、４个月。４ＣＬ反应后的产物在２个不同梯度下通过Ｃ１８反相柱进一步纯化，并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中，所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶Ａ酯的容器都用锡箔纸完全包裹．．．
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
范丙友 陆海 蒋湘宁
4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)催化维管植物木质素生物合成羟基肉桂酸及其衍生物辅酶A酯化合物的形成.该文对我国乡土树种毛白杨重组Pt4CL1的酶学性质进行了初步研究,结果表明:Pt4CL1在高温下不稳定,10%甘油可部分提高其温度稳定性;Pt4CL1酶学反应最适温度为40℃;Pt4CL1在pH 3.0~8.0范围内比较稳定,当pH大于8.0时其Pt4CL1的稳定性下降;最适反应pH为8.0;Mg2+是Pt4CL1最适激活剂,EDTA可抑制其活性;Tris-HCl的最适浓度为0.2 mol/L;4-香豆酸是Pt4CL1的最适底物.
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
曹山 蒋璐瑶 李丽红 要笑云 张强 撖静宜 王莹 李慧 陆海
中链酰基辅酶Ａ合成酶（ＭＡＣＳ）属于腺苷酸合成酶超基因家族，催化中链脂肪酸与辅酶Ａ结合形成相应的中链酰基辅酶Ａ。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的４ＣＬ基因，克隆得到毛果杨Ｐｔ ＭＡＣＳ１的基因序列（基因编号：ｅＳｔ ｅｘｔ＿ｆｇｅｎｅＳｈ４＿Ｐｇ．Ｃ＿６４００６６）。通过序列分析可知，Ｂｏｘ Ｉ和Ｂｏｘ ＩＩ两个在４ＣＬ中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将Ｐｔ ＭＡＣＳ１与原核表达载体Ｐ ｅｔ－３０Ａ（＋）构建融合表达载体Ｐｔ ＭＡＣＳ１－Ｐ ｅｔ－３０Ａ（＋），转化大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３）后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析，研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张金 邹红 姚卫建 聂品
柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操作系统的研究进展较慢,而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达,有可能促进该细菌遗传操作系统的构建。本研究获得了柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因(acetyl-coenzyme A synthetase gene,acs)的编码序列及其上游调控序列,该基因全长2 323 bp,编码635个氨基酸。通过序列分析,发现在该基因起始密码子ATG的上游存在核糖体结合位点(ribosome biding site,RBS)序列TAAAA,和启动子–7和–33的保守基序TAT...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
饶国栋 张永卓 魏弘宜 蒋湘宁 陆海 张建国
为了进一步研究杨树4CL基因,以毛白杨为材料克隆到一个新的毛白杨4CL3基因。生物信息学分析结果显示:该基因和其他4CL基因一样含有4CL基因家族2个保守框Box I和Box II。将4CL3基因连接至原核表达载体pQE30,表达纯化后测定其蛋白的比活力,结果显示:4CL3基因对不同底物表现出了不同的催化效率。对该基因的最适温度和最适pH值测定后发现:4CL蛋白的最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且在pH=9.0时有60%的活力。采用HPLC-MS的方法,分析了4CL3蛋白对混合底物的催化情况,结果显示:在混合底物下,4CL3蛋白对4-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸都表现较高的活力,而对芥子酸和咖...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
齐玉洁 张鑫 杨夏 高中山 贾惠娟
【目的】根据国际桃基因组序列信息,进行克隆和表达分析与桃果实内酯类合成相关的果肉组织酰基辅酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase,ACX)的5个候选基因,为进一步开展桃香气物质代谢分子机理的研究提供新的研究方向。【方法】根据Phytozome(www.phytozome.org/peach)发布的桃ACX全基因组序列设计特异引物对5个基因全长进行克隆测序,与参考编码序列进行比对和编码蛋白性质进行分析,并对这些成员进行组织特异性表达分析。【结果】获得了桃果肉组织中表达的5个ACX编码基因全长序列,PpACX1、PpACX3的CDS区没有突变,PpACX2核苷酸序列871位处A突变为G,导致...
关键词：
桃 酰基辅酶A氧化酶 基因克隆 序列分析
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭永翠 秦江南 朱玲 张锐
为研究新疆核桃露仁机制,以露仁核桃种质温138为研究对象,其突变纸皮核桃为对照,采用RT-PCR技术克隆4CL基因并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法研究核桃硬化过程中4CL基因相对表达量,找到4CL基因在露仁核桃内果皮中硬核发育过程中的表达特性。结果表明,WJ-4CL基因cDNA序列包括552 bp ORF,编码184个氨基酸,分子质量20.10 ku,理论等电点5.83;ZJ-4CL基因包含453 bp ORF,编码151个氨基酸,分子质量16.52 ku,理论等电点9.35;系统进化树表明,温138与纸皮核桃聚为同一支,其亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,露仁核桃4CL基因在花后100 d的相对表达量为花后51 d相对表达量的117倍,硬壳完整核桃4CL基因在花后86 d相对表达量为花后51 d相对表达量的205倍,初步证明4CL基因在硬壳完整和露仁核桃的不同发育时期表达量存在明显差异。表明4CL基因参与核桃内果皮(硬壳)硬化过程且影响内果皮木质素的合成,从而造成核桃内果皮发育不全,出现露仁现象。
[期刊] 林业科学
[作者]
范丙友 陆海 蒋湘宁
在大多数维管植物中4CL以基因家族形式出现。4CL基因成员在植物组织中差异表达,参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成。4CL基因的表达受发育调控,其表达还能被环境因子激活,如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等。4CL具有高度趋异的底物偏好性及底物特异性,决定4CL同工酶底物特异性的因素可能是结合沟的空间限制而不是底物和多肽链之间的特异性相互作用。在4CL氨基酸序列中存在2个保守的肽基序(motif),肽基序BoxⅠ,SSGTTGLPKGV,肽基序BoxⅡ,GEICIRG。应用反义技术已经成功地将4CL基因用于调控模式植物拟南芥、烟草及木本植物美洲山杨、毛白杨木质素的生物合成。未来的研究应侧重以下...
关键词：
4-香豆酸:辅酶A连接酶 维管植物
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
王晓雪 蒋湘宁 陆海
通过对毛白杨中的4-香豆酸:辅酶A连接酶1(Pt4CL1)蛋白第338位缬氨酸进行缺失突变,从而获得了具有芥子酸催化活性的Pt4CL1蛋白突变体338dVal。与野生型4CL1蛋白活性相比较,该突变体获得了催化芥子酸的活性,比活力是(1.62±0.34)nkat/mg。同时,对4-香豆酸催化活性有轻微的降低(约降低12%),对咖啡酸的催化活性有明显增加(约增加126%),对阿魏酸的催化活性有部分的降低(约降低29%),对肉桂酸的催化活性没有显著变化。该结论证实了第338位缬氨酸对底物芥子酸5位甲氧基具有空间位阻效应。该项研究为通过基因工程技术调控木质素的合成提供了新的方法。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
谭烽 兰文升 崔峰 乔传令 陈雯莉
利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯度较高的乙酰胆碱酯酶。参照Ellman法对酶的活性进行测定,结果显示纯酶的活力为2.219×10-4 mol/(min.g)。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈莹 王晓峰 陈少林
【目的】对玉米中长链酰基辅酶A合成酶1(ZmLACS1)基因及其蛋白磷酸化位点进行鉴定,为研究玉米脂肪酸的降解及其利用机制奠定基础。【方法】通过结构域分析查找质谱鉴定到蛋白中的长链酰基辅酶A合成酶1,通过系统发育树分析判断玉米中长链酰基辅酶A合成酶1与拟南芥超家族中长链酰基辅酶A合成酶的同源性,通过质谱分析鉴定该蛋白的磷酸化修饰位点。通过3D建模模拟长链酰基辅酶A合成酶1的结构以及磷酸化位点所在位置。【结果】玉米长链酰基辅酶A合成酶1(ZmLACS1)与拟南芥中的长链酰基辅酶A合成酶1(AtLACS1)具有高度同源性;通过质谱分析鉴定到3个该蛋白的磷酸化位点分别为S360、Y365和S366,同时鉴定到的磷酸化位点位于长链酰基辅酶A合成酶的保守结构域(AMP-binding domain)中,3个磷酸化位点位置一致,位于两个α螺旋中间,处于蛋白结构的关键位置。【结论】磷酸化修饰可能是调节长链酰基辅酶A合成酶1功能的关键性方式之一,ZmLACS1可能与AtLACS1在功能上具有相似性。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
徐浩 杨克彬 朱成磊 李英 高志民
[目的]为研究肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因表达对竹子木质素生物合成的影响,对毛竹(Phyllostachys edulis (Carrière) J. Houz.)中PeCCR基因的表达情况进行分析,并对PeCCR基因功能进行研究,以期为利用CCR基因在竹子中开展基因工程育种提供参考依据。[方法]采用实时定量PCR(qRT-PCR)方法对PeCCR基因在毛竹不同组织以及不同高度笋中的表达进行了分析,采用RT-PCR方法克隆了PeCCR基因的编码区,构建了基因过量表达载体,采用蘸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),采用溴乙酰法测定转基因植株茎木质素的含量。[结果]qRT-PCR结果表明:在毛竹实生苗根中PeCCR的表达量最高,其次是笋中,而未展开叶中最低;在野外随着笋高度的增加,木质化程度加强,PeCCR基因的表达量呈上升趋势,在6.7 m笋中达到最高。克隆获得PeCCR编码区长度为1 026 bp,编码一个341 aa的蛋白,具有家族蛋白特有的保守结构域"NWYCYGK"。与野生型拟南芥相比,转PeCCR基因植株叶片明显增大,且抽苔时间提前3～4 d。茎横切的组织化学染色观察发现:转基因植株茎的木质部和束间纤维组织染色面积均大于野生型;木质素含量测定表明,2个过表达PeCCR1转基因株系中的木质素含量均明显高于野生型,分别为野生型对照的123.1%和116.7%。[结论]PeCCR基因在毛竹不同组织的表达存在差异,在笋中随高度增加其表达量上调。过量表达PeCCR促进了转基因拟南芥植株的生长发育,提高了木质素含量。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吕娟娟 王进军 高新菊 沈慧敏
【目的】克隆二斑叶螨(Tetranychus urticae)的乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACCase)基因,对其进行生物信息学分析并研究其在二斑叶螨敏感和抗性品系中的表达量。【方法】利用RT-PCR技术克隆ACCase基因的cDNA全长,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性;利用实时荧光定量PCR方法分析ACCase基因在二斑叶螨敏感和抗螺螨酯品系中的表达差异。【结果】ACCase基因(GenBank登录号:JX424763)的开放阅读框长度为7 068 bp,编码2 235个氨基酸,分子量约为266.35 kD,理论等电点为6.38,包含典型的...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
何靖玄 黄丽华 黄妤 张学文
线粒体琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)含有4个酪氨酸残基,其4、76位点酪氨酸(Tyr4、Tyr76)的硝基化可导致其酶活性下降,制备特定的抗体可对其硝基化水平和位点进行检测。应用淋巴细胞杂交瘤技术,以化学合成的含琥珀酰辅酶A转移酶硝基化Tyr4和Tyr76肽段为半抗原,偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)后,作为免疫原免疫Balb/c小鼠,分离免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了多株融合细胞。经对融合细胞多次筛选和检测,最终获得4株单克隆抗体,分别对应SCOT Tyr4和Tyr76硝基化后表位,其间接ELISA检测效价分别达到1∶128 000、1∶32 000、1∶512 000和1∶4 ...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
范丙友 胡诗宇 陆海 蒋湘宁
为了进一步研究毛白杨4CL1的酶学特性,构建了毛白杨4CL1原核表达载体pQE31--4CL1.经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了毛白杨4CL1蛋白,SDS--PAGE电泳分析表明该新蛋白的分子量为60 kD,与预测值一致.对毛白杨4CL1蛋白在大肠杆菌中的表达体系进行了优化,确定IPTG的最佳浓度为0.4 mmol/L,诱导时的菌液密度OD600为0.3~0.5,最佳表达时间为2 h.37℃下表达的4CL1融合蛋白以包涵体的形式存在,没有生物学活性.当表达温度从37℃降低为28℃时,可溶性的有生物学活性的毛白杨4CL1蛋白诱导表达获得成功,表达量达11%.以耦联有Ni2+--NTA的琼脂糖为亲...
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