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[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
韩芳 王志勇 巫旗生 王晓清
将对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的功能基因wsv477克隆到原核表达载体PGEX-4T-2中,并转化大肠杆菌BL21,37℃条件下诱导了WSV477蛋白的表达,并以纯化的融合蛋白作为抗原,免疫小鼠获得了多克隆抗体.该基因开放阅读框共624个核苷酸,编码208个氨基酸,GST融合蛋白相对分子质量为49000,抗体滴度为1:10000.RT-PCR和Western blot分析表明,该基因在病毒感染4h后开始转录,6h后开始表达,是WSSV感染的早期基因.
[期刊] 水产学报
[作者]
邓康裕 史晓丽 张莹雪 孟宪红 孔杰 罗坤 栾生
采用ＲＡＣＥ技术克隆获得中国明对虾ＣＡｓｐＡｓＥ２基因ＣＤＮＡ序列全长，并对该序列进行分析。结果显示，中国明对虾ＣＡｓｐＡｓＥ２基因全长为１５１７ ｂｐ，开放阅读框长９２４ ｂｐ，５＇非编码区长７８ ｂｐ，３＇非编码区长５１５ ｂｐ，命名为ＦＣＣＡｓｐ２。推测该基因编码３０７个氨基酸，预测分子量为３４．２１ ｋｕ，理论等电点为７．６２。同源性和系统进化分析发现，ＦＣＣＡｓｐ２基因与凡纳滨对虾ＣＡｓｐＡｓＥ２和斑节对虾ＣＡｓｐＡｓＥ的相似性分别为８８％和８０％，与其他节肢动物ＣＡｓｐＡｓＥ家族基因聚为一类。荧光定量ＲＴ－ｐＣＲ结果显示，ＦＣＣＡｓｐ２基因在肝胰腺中的相对表达量最高，在肌肉中表达量．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
史晓丽 孟宪红 孔杰 栾生 罗坤 曹宝祥 曹家旺 陈宝龙
醛缩酶(FBA)是糖酵解和糖异生中的关键酶,参与多种生物过程。本研究采用RACE技术,克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)FBA基因(Fc FBA)的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,中国明对虾Fc FBA基因的c DNA全长为2496 bp,其中,ORF长1098 bp,5~′UTR长79 bp,3~′UTR长1319 bp。完整的阅读框编码365个氨基酸,分子量为39.8 k Da,预测的理论等电点为6.6。同源性及系统进化分析表明,Fc FBA与节肢动物的FBA聚为一类,与卤虫(Artemia franciscana)、家蚕(Bombyx mori)、沙漠蝗(Schistocerca gregaria)的相似度分别是86%、79%和78%。荧光定量PCR结果显示,Fc FBA在肌肉中的相对表达量最高,肝胰腺中最低。WSSV感染后,该基因在鳃、肝胰腺和肌肉中呈现出不同的时空表达特点。ds RNA干扰24 h以后,抑制效率达到最大。与PBS对照组相比,Fc FBA干扰组(ds RNA组)加快了对虾染病后的死亡速度。本研究表明,Fc FBA基因可能参与了中国明对虾生物胁迫的应答反应。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
史晓丽 孟宪红 孔杰 栾生 罗坤 曹宝祥 曹家旺 陈宝龙
醛缩酶(FBA)是糖酵解和糖异生中的关键酶,参与多种生物过程。本研究采用RACE技术,克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)FBA基因(Fc FBA)的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,中国明对虾Fc FBA基因的c DNA全长为2496 bp,其中,ORF长1098 bp,5′UTR长79 bp,3′UTR长1319 bp。完整的阅读框编码365个氨基酸,分子量为39.8 k Da,预测的理论等电点为6.6。同源性及系统进化分析表明,Fc FBA与节
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
祝孟茹 问露洁 占铭 公洁 席昌俊 闻海波 沈怀舜
为了解自噬相关基因Atg2在克氏原螯虾(Procambarus clarkia)先天免疫中的作用，本研究克隆了克氏原螯虾Atg2 (PcAtg2)基因全长序列。生物信息学分析显示，PcAtg2蛋白编码序列全长为9966 bp，推测其编码2189个氨基酸。组织定量表达分布显示，PcAtg2在克氏原螯虾的各个组织中均有表达，其中在肝胰腺中表达最高，在眼柄中表达最低。在白斑综合征病毒(WSSV)感染实验中，PcAtg2基因表达量在不同组织中均呈现显著上调趋势。RNA干扰(RNAi)实验显示，PcAtg2基因沉默后，WSSV在克氏原螯虾体内的增殖明显被抑制，同时自噬相关基因的表达量上调。透射电镜分析结果显示，在WSSV感染后，PcAtg2基因沉默组中克氏原螯虾肝胰腺组织中的自噬小体多于对照组。本研究结果可为了解克氏原螯虾应对WSSV胁迫下的调控机制提供理论参考。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
陈文博 谭珍一 刘庆慧 侯林 黄倢
根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pBAD/gⅡIA-VP28并转化大肠杆菌E.coli。用L-阿拉伯糖在37℃诱导重组基因工程菌,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,显示有与预期大小31kDa相符合的目的蛋白。荧光显微镜方法分析显示,表达的VP28可与克氏原螯虾血细胞结合。结果表明,在合适的培养条件下,构建的重组表达载体pBAD/gⅡIA-VP28不仅能够表达vp28基因,而且表达的VP28具有很高的抗原结合活性。
关键词：
白斑综合症病毒 vp28 表达 活性分析
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
薛倩 李旭鹏 李洋 栾生 罗坤 孔杰 邢群 孟宪红
本实验室前期研究中基于全基因组关联分析(GWAS)方法筛选到抗白斑综合征病毒(WSSV)候选基因：parkin共调基因(PACRG)。PACRG与帕金森病相关基因parkin共用一个双向启动子，二者共同参与细胞自噬过程，从而在细胞保护方面发挥作用。本研究对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) PACRG和parkin在抗WSSV中的功能进行探讨。对mRNA和氨基酸序列进行特征分析，利用real-time PCR技术检测对虾感染WSSV后不同时间、不同组织中的表达水平。通过荧光原位杂交技术(FISH)进行空间定位。利用PCR和Sanger测序技术获得单核苷酸多态性位点(SNP)并进行抗WSSV的关联分析。结果显示，PACRG开放阅读框(ORF)序列全长600 bp，编码199个氨基酸，预测包含一个ParcG结构域。parkin ORF序列全长1 653 bp，编码550个氨基酸，预测包含UBQ、IBR结构域和一个信号肽结构。与多物种进行同源序列比对发现，凡纳滨对虾PACRG氨基酸序列与日本对虾(Penaeus japonicus)的同源性高达89.70%；凡纳滨对虾parkin氨基酸序列与中国对虾(Penaeus chinensis)和斑节对虾(Penaeus monodon)的同源性高达93.45%。PACRG和parkin蛋白的保守性较高。感染WSSV后，PACRG和parkin在对虾肝胰腺、鳃、肌肉和眼柄中的表达水平发生显著变化，其中，眼柄中PACRG和parkin表现出极相似的组织表达模式。在肌肉中，PACRG mRNA和WSSV在空间位置上呈现高度重叠状态。结合上述结果，推测PACRG和parkin在凡纳滨对虾与WSSV的互作中发挥功能。在PACRG中筛选到2个SNP位点，在parkin中筛选到15个SNP位点，其中位于parkin非翻译区(UTR)的5个SNP位点与抗WSSV性状显著相关。本文为研究凡纳滨对虾抗WSSV的分子机制和抗病分子育种提供了理论依据和参考数据。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王晓兰 贡成良 薛宇醒 曹广力 魏育红 陈辉 许雅香 张伟明 薛仁宇
根据已公布的罗氏沼虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因序列设计一对特异性引物,从疑似患白斑病毒病的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中提取总DNA,并以此为模板,经PCR扩增、克隆并测序后将该片段通过GenBank比对,证实为WSSV的VP28基因;与20个已公布的WSSV VP28进行同源性比较,结果显示:从中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、日本对虾、波纹龙虾提取的病毒株聚为一类,印度对虾WSSV VP28为另一类,罗氏沼虾WSSV VP28又单独为一类。根据测序结果推测VP28蛋白的二级结构在氨基酸的7～29区间可能为跨膜螺旋区,且该区域高度保守。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
孙凡 刘庆慧 黄倢
采用实时荧光定量PCR技术分析白斑综合征病毒(WSSV)感染凡纳滨对虾不同时段鳃、肠、肝胰腺、肌肉、类淋巴和血细胞组织中热休克蛋白(HSP)60和90基因mRNA转录水平的变化。结果显示,HSP60和HSP90在这6个组织中都有表达,WSSV感染影响各组织中HSP60和HSP90mRNA转录水平的表达,WSSV感染抑制HSP60在鳃、肠、肌肉和血细胞的表达,促进HSP90在鳃、肠、肝胰腺、肌肉、血细胞和类淋巴的表达,表明HSP60和HSP90参与WSSV感染免疫反应。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘鹏飞 刘庆慧 吴垠 黄倢
为比较凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）的氧化反应和信号转导相关基因在白斑综合征病毒（Ｗｓｓｖ）感染中的变化情况，采用实时荧光定量ｐＣＲ，分析Ｗｓｓｖ感染凡纳滨对虾６、１２、２４、４８、７２ ｈ后，鳃和类淋巴组织中硫氧还原蛋白（ｔＲｘ）、ｐ３８信号通路（Ｌｖ ｐ３８）、过氧化氢酶（Ｃａｔ）及过氧化物酶（ｐｏＤ）在ｍ Ｒｎａ转录水平的变化。结果显示，感染对虾的类淋巴组织中，ｔＲｘ、Ｌｖ ｐ３８、Ｃａｔ、ｐｏＤ在７２ ｈ时表达量最高，与对照组差异显著（ｐ
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘鹏飞 刘庆慧 吴垠 黄倢
为比较凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的氧化反应和信号转导相关基因在白斑综合征病毒(WSSV)感染中的变化情况,采用实时荧光定量PCR,分析WSSV感染凡纳滨对虾6、12、24、48、72 h后,鳃和类淋巴组织中硫氧还原蛋白(TRx)、p38信号通路(Lv P38)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)在m RNA转录水平的变化。结果显示,感染对虾的类淋巴组织中,TRx、Lv P38、CAT、POD在72 h时表达量最高,与对照组差异显著(P
[期刊] 中国水产科学
[作者]
姜有声 战文斌 程顺峰 王世表
为了更好地研究对虾白斑综合征病毒(WSSV)蛋白VP19在WSSV感染过程中的作用,利用VP19的单克隆抗体直接对VP19进行了定位。从患白斑综合征的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃丝中提取WSSV,将提纯的WSSV经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后洗脱提纯其病毒蛋白VP19并免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,用间接免疫荧光技术(IFAT)和Western-Blot技术筛选出1株阳性杂交瘤细胞,将检测出的阳性杂交瘤细胞经有限稀释法克隆,研制出抗VP19的单抗,再利用免疫胶体金技术对病毒蛋白VP19进行定位,结...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张平 李晨 黄倢 梁艳 刘庆慧 刘莉
将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
耿小雪 王小霞 周怡 徐玮 张文兵 麦康森
近年来，重组ＶＰ２８和ＶＰ２６蛋白作为蛋白亚单位疫苗，在增强对虾抗白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）感染的过程中具有重要作用。本研究根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中ＷＳＳＶ的基因序列设计引物，以ＷＳＳＶ粗提液为模板进行普通ＰＣＲ扩增，得到ＶＰ２８和ＶＰ２６基因，再用引物悬挂法将ｅＣｏ ＲⅠ和ＸＢａⅠ酶切位点分别添加到ＶＰ２８和ＶＰ２６基因的５端和３端。目的基因经双酶切后插入到表达载体Ｐ ＧａＰＺαａ，转化ＴｏＰ１０大肠杆菌，经博莱霉素（ＺｅｏＣｉｎ）抗性筛选阳性重组酵母表达载体。ａＶＲⅡ酶切线性化之后，电击转化Ｘ－３３毕赤酵母感受态细胞，经ＺｅｏＣｉｎ抗性筛选得到阳性重组酵母。ＳＤＳ－ＰａＧｅ电泳分析重组酵母表．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
张正阳 张春莉 施定基 贾晓会 贾睿 何培民
VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到p ET-28a(+)表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体p ET-28a-VP28。转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose C
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