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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张存政 刘贤进 余向阳 王冬兰 高亮
将对硫磷代谢类似物进行了改造 ,以重氮化方法使之分别与牛血清蛋白 (BSA)、卵清蛋白 (OVA)载体蛋白连接 ,并分别作为免疫原与包被原进行抗血清制备及ELISA试验 ,结果产生了特异性抗体。在对硫磷的标准抑制曲线中 ,当pH 7 4时 ,I50 为 5 2ng·mL-1,检测限可低于 0 1ng·mL-1。交叉试验表明 :产生的特异性抗体与对硫磷反应明显 ,与其代谢的初级产物有交叉反应 ,与结构类似物 4硝基苯酚及其他类似物交叉反应不明显 ,与甲基对硫磷的交叉反应亦不明显
关键词：
对硫磷 半抗原 免疫分析 免疫优化
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘贤进 颜春荣 刘媛 余向阳 张存政
【目的】制备针对有机磷农药的广谱特异性抗体,用于有机磷农药的免疫快速筛选检测。【方法】设计采用二乙基膦酸乙酸作为通用结构半抗原,用NHS-DCC法和EDC法合成两种人工抗原免疫新西兰大白兔制备抗血清。【结果】NHS-DCC法所制得抗血清的最高滴度为25600,EDC法合成的抗原制得的抗血清滴度最高为6400,均获得免疫应答。以二乙基膦酸乙酸为对象建立的间接竞争ELISA检测方法对二乙基膦酸乙酸最低检测浓度0.0035μg·ml-1,抑制中浓度I50为0.182μg·ml-1。经对12种常见磷酸酯类有机磷农药特异性检测反应试验,结果发现:所得抗体对毒死蜱、氧乐果、二嗪农、乙基对硫磷、丙溴磷、辛硫...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
罗利 张静 刘媛 余向阳 马志卿 冯俊涛 刘贤进 张兴
【目的】获得抗川楝素的高灵敏度,高特异性多克隆抗体,建立川楝素的间接竞争酶免疫测定(IC-ELISA)方法。【方法】采用酯化反应合成川楝素的半抗原并经HRMS,NMR及IR鉴定;用混合酸酐法和活化酯法分别合成人工免疫抗原与包被抗原;通过免疫动物获得多克隆抗体。【结果】合成了琥珀酸单酰川楝素(TS)和戊二酸单酰川楝素(TG)2种半抗原,与载体蛋白BSA和OVA分别偶联制备了2种免疫原TS-BSA和TG-BSA,及2种包被原TS-OVA和TG-OVA。免疫后获得的2种抗体效价达6.4×104和3.2×105。经4种不同包被原-抗体组合优化,以(TS-Ab,TG-OVA)组合建立的川楝素IC-ELI...
关键词：
川楝素 半抗原 多克隆抗体 ELISA
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
窦兰清 傅宝权 牛炳亨 朱兴全
为了明确猪在免疫旋毛虫抗原和感染旋毛虫肌幼虫后的抗体应答反应,应用 ELISA 法,肌幼虫凝胶层析纯化抗原、新生幼虫和成虫可溶性抗原,对用肌幼虫可溶性抗原、肌幼虫 ES 抗原、成虫可溶性抗原、成虫 ES 抗原、灭活新生幼虫抗原制备的免疫原免疫后猪血清抗体以及攻击感染后的猪血清抗体进行了检测。用肌幼虫纯化抗原检测时,感染猪在感染后7d 抗体即出现变化,第14～21d 时上升较快,第28d 达最高值,抗体可持续6个月以上;各免疫组在第1次免疫后抗体滴度有不同程度升高,第2次免疫后上升较快,其中肌幼虫可溶性抗原及其 ES 抗原免疫组抗体应答较其它几种抗原免疫组强。用成虫可溶性抗原检
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王红丽 康海泓 杨倩
为探讨鸭源禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫雏鸭的效果,应用鸭源禽流感灭活抗原与复合黏膜免疫佐剂(CpG和/或葡萄糖)饮水免疫雏鸭,检测消化道(主要是咽和小肠)抗体分泌细胞的变化。首先分别从鸭的胆汁和血清中粗提免疫球蛋白A(IgA)和IgG,经纯化后制备了兔抗鸭IgA和IgG,然后应用免疫组化技术显示鸭消化道IgA和IgG分泌细胞。试验结果表明:用禽流感灭活抗原配合CpG和/或葡萄糖饮水免疫后3、5和7周,消化道黏膜局部IgA分泌细胞面积均显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),IgG分泌细胞(除首免后第3和7周小肠外)极显著升高(P<0.01)。而单独用禽流感灭活抗原和用葡萄糖配合禽流...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张晓文 杨倩
分别在禽流感灭活抗原(H5N2)中添加黏膜免疫佐剂CpG(CpG佐剂组)和重组IL-2(IL佐剂组),经过鼻腔免疫鸡群后研究呼吸道各段抗体分泌细胞的分布和数量变化。结果发现:在鼻腔免疫后第3周和第5周CpG佐剂组肺单位视野中IgA分泌细胞面积显著高于对照组(生理盐水)(P<0.05),CpG佐剂组和IL佐剂组肺和气管、气管叉单位视野中IgG分泌细胞面积和数量均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);免疫后第5周和第7周CpG佐剂组气管和气管叉单位视野中IgA分泌细胞面积显著高于对照组(P<0.05)。免疫后第7周2个试验组气管叉中IgG分泌细胞数量极显著高于对照组(P<0.01)...
[期刊] 水产学报
[作者]
王丽 桑亚新 周群标 王向红
采用活化酯法将大田软海绵酸(OA)与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备免疫抗原(OA-KLH),用还原聚丙烯酰胺凝胶电泳法和红外光谱法对人工抗原的偶联效果进行分析,通过免疫兔子制备抗体,所得抗血清经Protein A凝胶层析柱纯化处理后,用紫外全波长扫描和间接竞争ELISA法验证纯化效果。结果表明,免疫抗原偶联成功并获得了高亲和力的多克隆抗血清,抗血清纯化后浓度为2.16 mg/mL,间接竞争ELISA测定其滴度为12 800、IC15为3.41 ng/mL,为建立快速、经济的检测方法打下了基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
崔峥 朱小玲 邱高峰
Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Western-blotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni2+-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘剑华 刘连瑞 李灵娟 徐立新 严若峰 李祥瑞 宋小凯
[目的]在前期研究中,筛选到了存在于多种鸡球虫间的共同抗原泛素缀合酶结构域蛋白(UCE),本研究进一步分析其免疫原性,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[方法]提取纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增堆型艾美耳球虫UCE基因(EaUCE),插入pVAX1质粒,构建真核表达质粒pVAX-EaUCE,通过RT-PCR和Western blot检测pVAX-EaUCE在鸡体内的转录和表达情况。经流式细胞术和间接ELISA法检测pVAX-EaUCE免疫后鸡体细胞免疫和体液免疫水平变化,分析其免疫原性。分别采用柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫及三者的混合卵囊人工感染雏鸡,观察感染前、后雏鸡体质量变化和排出卵囊减少量,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[结果]EaUCE基因开放阅读框为444 bp,编码148个氨基酸,BLAST分析显示,柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫UCE氨基酸序列同源性均大于95%。pVAX-EaUCE能够在鸡体内成功转录和表达。pVAX-EaUCE免疫后,鸡体的CD_4~+/CD_3~+和CD_8~+/CD_3~+细胞比例显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D、TGF-β4 mRNA和IgY抗体水平显著升高,表明免疫该质粒能诱导细胞和体液产生免疫反应(P<0.05)。pVAX-EaUCE免疫后,与对照组相比,免疫组鸡体质量显著增加,卵囊产量明显下降,肠道损伤也相应减轻。[结论]鸡球虫共同抗原UCE具有良好的免疫原性,可对多种球虫感染提供部分免疫保护力,有望成为抵抗多种球虫感染的候选抗原。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
钟艺煊 王彦红 杨成根 邹辉 顾建红 袁燕 卞建春 刘学忠
为获得纯度更高的吡虫啉人工半抗原，通过对常规半抗原合成的反应顺序、试剂等进行调整和优化，筛选出最适3-巯基丙酸反应比例，采用薄层层析色谱法、质谱法和核磁共振法对合成的吡虫啉半抗原分子结构进行确证，进一步用合成的吡虫啉半抗原与载体蛋白偶联得到吡虫啉完全抗原并免疫小鼠，于三免和五免7天后断尾采血，采用间接ELISA法测定小鼠血清抗体效价。结果表明：1）吡虫啉、反应体系、有机相和水相的比移值分别为0.55、0.23、0.50和0;2）质荷比为326的峰是吡虫啉半抗原的分子离子峰，且其余杂质离子峰的数量明显下降；3）核磁共振结果与吡虫啉半抗原相符，3-巯基丙酸氧化副产物峰下降；4）三免后，小鼠血清效价达到1∶12 800，五免后，小鼠血清效价可达1∶51 200。综上，此优化方法不仅保证3-巯基丙酸完全反应，还减少3-巯基丙酸氧化副产物和不必要杂质的产生，提供了一种操作简单、安全，同时可减少半抗原合成过程杂质产生的吡虫啉半抗原合成优化方法，为后续吡虫啉单克隆抗体的制备提供便利。
关键词：
吡虫啉 半抗原 合成 优化
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李俊锁 李喜旺 王明安
本试验合成了4个模拟磺胺类药物母核结构的半抗原，使用1HNMR，FABMS和IR对半抗原结构进行了鉴定。产物结构中，4种间隔臂均位于对氨基本磺酞肤的N1端（-SO4NH-，突出了磺腔类药物的共同结构部分，为预期的半抗原。
关键词：
磺胺类药物 半抗原合成
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨笑笑 杨兴淼 刘亚林 曹瑞兵
[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于30GENRCWVRAIDVGYMC45，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。
[期刊] 水产学报
[作者]
朱春华 刘荭 刘晓东 杨金先 郑在予 林天龙
以纯化的中华鳖虹彩病毒为抗原免疫Balb/C小鼠,取免疫鼠脾细胞经杂交融合获得了8个能稳定分泌抗中华鳖虹彩病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚级份分析结果表明,M ab2A4属IgA,M ab8E1是IgG2a,其他的6株单抗M ab1D3、M ab2H1、M ab3A1、M ab4B5、M ab5E1和M ab6F2均为IgG1。酶联免疫吸附剂测定(ELISA)分析表明,8株单抗均能特异性地识别中华鳖虹彩病毒,与EPC、CO、FHM等宿主细胞不产生交叉反应,腹水抗体的ELISA效价在105~106。IFA分析表明,8株单抗中仅M ab5E1没有免疫荧光反应特性,其余7株单抗均能对...
关键词：
中华鳖 虹彩病毒 单克隆抗体 抗原
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王雯 佟贺 杨兴淼 曹瑞兵
[目的]本研究旨在制备抗鹅星状病毒（goose astrovirus，GAstV）单克隆抗体，并鉴定其识别的抗原表位，为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。[方法]通过原核表达系统表达并纯化GAstV-2 P2蛋白，将其做为免疫原免疫六周龄BALB/c雌鼠，利用杂交瘤技术，经过细胞筛选和亚克隆，获得3株能稳定分泌抗P2蛋白的单克隆抗体，利用Western Blot和间接免疫荧光（IFA）鉴定单抗特异性，用获得的单抗对阴阳性肾脏切片进行免疫组化检测，用间接ELISA测定单抗效价和亚型，同时构建P2蛋白的不同截短体来鉴定得到的单抗识别的抗原表位。[结果]本研究获得三株能稳定分泌抗P2蛋白抗体的杂交瘤细胞，命名为1B10、3C6、5B1。单抗效价分别为1:2048000、1:512000、1:256000，亚型鉴定结果显示，三株单抗的重链均为IgG2b，轻链均为Kappa型。Western Blot和IFA结果显示，三株单抗均可以特异性结合鹅星状病毒，免疫组化结果显示，5B1和3C6可以应用于免疫组化的检测。表位结果显示，1B10识别109TSTTSTGGLITELRN123，3C6识别206LTDPEEDDDPLS217，5B1识别96LNPELETAVLRV107。[结论]本研究成功制备识别不同抗原表位的三株单克隆抗体，为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵杰 高美须 潘家荣 王志东 兰丽平 睢珂 许舒婷 刘超超 牟慧
【目的】建立一种识别、检测致敏蛋白的新方法。【方法】Pen a 1为虾中主要的致敏蛋白,从其5个主要IgE结合区中选择一段具有代表性的(85—105位)含21个氨基酸的多肽序列,进行化学合成,将多肽分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,制得免疫原和包被原,免疫原免疫新西兰纯种白兔得到多克隆抗体。以刀额新对虾蛋白、卵清蛋白、花生蛋白和牛奶蛋白为样品,免疫印迹鉴定多克隆抗体对刀额新对虾中Pen a 1蛋白的特异性。【结果】经Ellman试剂测定多肽与KLH、BSA的偶联比分别为12﹕1和8﹕1。间接非竞争ELISA测定多克隆抗体的效价达1.024×106,间接竞争ELISA(i...
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