通过生物信息学分析,在链霉菌SH-62的基因组中发现一个Ⅱ型聚酮合酶基因簇(ents),与已报道的来源于Streptomyces maritimus的肠菌素生物合成基因簇具有高度的相似性。通过构建和筛选链霉菌SH-62的基因组细菌人工染色体(BAC)文库,克隆得到完整的ents基因簇。将ents基因簇导入白色链霉菌中进行异源表达,HPLC和LC-MS分析结果表明该基因簇负责肠菌素的生物合成,从而证实了ents基因簇的生物学功能。

通过生物信息学分析,在链霉菌SHG62的基因组中发现一个Ⅱ型聚酮合酶基因簇(ents),与已报道的来源于Streptomycesmaritimus的肠菌素生物合成基因簇具有高度的相似性.通过构建和筛选链霉菌SHG62的基因组细菌人工染色体(BAC)文库,克隆得到完整的ents基因簇.将ents基因簇导入白色链霉菌中进行异源表达,HPLC和LCGMS分析结果表明该基因簇负责肠菌素的生物合成,从而证实了ents基因簇的生物学功能.

[目的]分析玉米大斑病菌寄主选择性毒素(host selective toxin,HST)生物合成基因簇Cluster 397.3的结构,以及该基因簇组成基因在玉米大斑病菌侵染过程中的表达情况,为玉米大斑病菌HST的结构和功能研究奠定基础。[方法]以玉米大斑病菌23号生理小种et28a和01-23菌株,1号生理小种ny001和01-11菌株,玉米感病自交系B37为材料,利用antiSMASH技术预测玉米大斑病菌次生代谢产物合成基因簇,通过Synteny共线性分析获得玉米大斑病菌HST生物合成基因簇Cluster 397.3,并对其基因组成和结构进行分析,再利用RNA-Seq技术分析该基因簇的组成基因在玉米大斑病菌侵染玉米叶片3,5,7,10 d的表达情况。[结果]玉米大斑病菌次生代谢产物合成基因簇Cluster 397.3与交链链格孢(Alternaria alternata) ACT-毒素合成基因簇有保守的共线性,含有1个聚酮合酶(PKS)、1个氨基甲酰磷酸合成酶(CPS)、1个短链脱氢酶/还原酶(SDR)、1个锌结合氧化还原酶(ZOR)、1个保守假定蛋白(CHP)、2个细胞色素P450(P450)及2个耐药转运蛋白(DRT)等9个基因。其中PKS与ACT-毒素合成酶基因ACTTS3同源,编码的聚酮合酶包括PksD、PS-DH、Methyltransf_12、PKS_KR、PKS_NbtC superfamily和NADB_Rossmann superfamily 6个典型结构域。RNA-Seq分析结果表明,将玉米大斑病菌接种玉米叶片3,5,7,10 d后,Cluster 397.3组成基因均能表达,且以3 d时表达量整体较高;除CHP基因外,01-11菌株中基因表达量均显著高于01-23菌株。[结论]Cluster 397.3基因表达差异与玉米大斑病菌生理小种的分化和致病特异性有关,该基因簇可能参与了玉米大斑病菌寄主选择性毒素的生物合成。

hrp基因是植物病原细菌中一类重要的致病基因,一般成簇排列。对14种已完成全基因组测序的植物病原细菌基因组中的hrp基因簇进行了大小、G+C含量、基因组成的BlastP比较。发现它们的大小在18～24 kb,由22～28个基因组成。欧文氏菌属和假单胞菌属的菌株中G+C含量较低,拉尔氏菌属和黄单胞菌属菌株的G+C含量较高。而且,各菌属的基因簇都有其独有的hrp基因,如假单胞菌属是hrpK1、hrpV、hrpA;欧文氏菌属是hrpT、hrpV、hrpA;拉尔氏菌属是hrpZ、hrpX、hrpY、hrpV;黄单胞菌属是hrpE、hrpD6、hpaA。其中,基因hrpA1、hrpA、hrpY和hrpE...

通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定，结合ＤＮＡ序列测定，从刺孢吸水链霉菌ＡＡ９７０２６中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇，获得１个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆１Ｈ５，其部分ＤＮＡ序列与链丝菌素生物合成基因相似。含１Ｈ５的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份，表明１Ｈ５含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。

[目的]从含盐环境中富集分离中度嗜盐菌,并进行菌种鉴定,分析确定与耐盐特性相关的主要相容性溶质,探索利用分离菌株合成四氢嘧啶的可行性。[方法]从盐池土中富集分离耐盐或嗜盐的乙酸降解菌,通过生理生化特性测定和16S rDNA序列的分析,将所得菌株鉴定至相应的属或种。通过摇瓶试验研究分离菌株耐盐生长的特征,从所得的菌株中提取、分析相容性溶质并测量其含量,初步分析分离菌株耐盐生长的机制。在高盐培养基中诱导嗜盐菌胞内相容性溶质的合成,然后在低渗盐溶液中测定相容性溶质的释放率,之后再将菌体转移至高渗培养基中研究相容

从神农架烟草种植地土壤中分离出1株对7株农作物病原真菌具有抗性活性菌株,命名为ⅡR21菌株。采用琼脂块法测定,该菌株对稻瘟病菌、立枯丝核病菌、腐霉病菌、禾谷镰刀病菌和黄色镰刀病菌具有较强的抑菌活性。对该菌株的生理生化特性和16SrRNA基因序列同源性比对,初步鉴定ⅡR21菌株属于链霉菌属。经过有机溶剂萃取、硅胶柱层析、薄层层析和制备型高效液相色谱对ⅡR21菌株发酵液进行分离纯化,获得了1个纯度为90.34%的具有抗稻瘟病菌168菌株活性的化合物单体。采用高通量测序技术对ⅡR21菌株进行全基因组测序,通过全

【目的】利用RNA干扰技术探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS的功能。【方法】将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。利用聚乙二醇(PEG)介导的方法将之转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体中,通过潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子中StPKS的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建了StPKS RNA干扰载体并进行了成功转化,经潮霉素抗性筛选和PCR验证最终获得了9个阳性转化子,其中5个转化子菌落颜色变浅。对转化子进行半定量PCR分析发现...

【目的】克隆葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）糖基水解酶（glycosyl hydrolase,GH）基因（PvGH），分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式，研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡（PCD）以及影响烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染的能力，为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材，采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长，并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析；利用酵母信号肽诱捕系统（SST）验证PvGH的分泌活性；利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式；同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白，分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致，长度为1 092—1 392 bp，分别编码364—464个氨基酸，与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构域，其二级结构差异较大，三级结构与其他蛋白三级结构相似性较低，呈现非常独特的三级结构。使用SingalP 5.0软件对编码的蛋白进行信号肽预测，发现它们均含有20—26 aa的信号肽，但通过SST验证结果显示PvG09279和PvG13517并不具有分泌特性。保留、缺失或者替换信号肽的8个PvGH均可抑制BAX触发的本氏烟PCD，并促进烟草疫霉的侵染，表明PvGH效应蛋白发挥其毒力不依赖于信号肽。PvGH在葡萄霜霉菌侵染初期表达上调，进一步表明其在病原菌与寄主互作中的重要作用。【结论】在侵染寄主过程中，葡萄霜霉菌分泌的PvGH通过抑制寄主PTI反应参与致病过程。

为明确溶磷菌wj1的无机磷酸盐(Pi)的转运机制,对溶磷菌wj1磷酸盐特异性转运系统(Pst)进行生物信息学分析并与土壤中常见细菌的Pst系统进行比较,通过亚克隆构建溶磷菌wj1pstS蛋白的原核表达系统,利用钼酸铵分光光度法测定诱导表达的pstS蛋白对磷酸盐的结合率。结果表明:溶磷菌wj1的Pst系统是由pstS、pstC、pstA、pstB和phoU 5个基因组成,且依次分布于染色体上,这种结构与土壤中常见细菌的大多数菌属相似。溶磷菌wj1的pstS蛋白位于细胞质外,是一种具有信号肽的可溶性蛋白,其空间结构是由2个球状结构域组成。与绿脓假单胞菌的pstS蛋白结构相比,溶磷菌wj1pstS蛋白的活性中心位于两个球状结构域的裂缝中,其中有9个氨基酸参与Pi特异性结合,1个氨基酸通过疏水作用维持蛋白与Pi的结合。溶磷菌wj1pstS蛋白在大肠杆菌中过量表达后,使得重组大肠杆菌的无机磷酸盐吸收率显著提高,表明溶磷菌wj1pstS蛋白具有结合Pi的能力,但菌浓度不变时Pi浓度的增加会抑制溶磷菌wj1pstS蛋白对Pi的结合。

【目的】从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)中鉴定木糖苷酶基因,研究其与大丽轮枝菌致病力的关系,为解析大丽轮枝菌致病分子机制提供理论依据,同时为制定更好的棉花黄萎病防治策略提供科学依据。【方法】利用生物信息学方法从大丽轮枝菌基因组数据库中鉴定全部木糖苷酶基因,并对基因编码蛋白的结构域、基因的染色体定位及进化关系等进行分析。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品种根系分泌物培养0、6、12、24和48 h大丽轮枝菌中的表达量。利用寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)技术对木糖苷酶基因VdxyL3在大丽轮枝菌侵染过程中的功能进行初步分析。将VdxyL3的目标片段转化棉花,采用伤根法接种大丽轮枝菌Vd991,观察转化植株的表型,调查病情指数,同时利用qRT-PCR技术对植株中真菌生物量和VdxyL3的表达量进行检测。【结果】利用生物信息学方法从大丽轮枝菌中查找出13个木糖苷酶基因(VdxyL1—VdxyL13),其编码序列长度介于1 461—2 544 bp,蛋白质分子量介于38.78—90.97 kD,理论等电点介于4.67—5.89。结构域和进化树分析发现13个木糖苷酶基因中包括9个糖苷水解酶43家族成员、1个3家族成员和3个31家族成员。染色体定位分析发现13个基因分布在6条染色体上,未形成基因簇。qRT-PCR结果发现选取的6个基因均受到根系分泌物的诱导,在一种或多种根系分泌物中培养6 h或12 h后,表达量均明显升高,然后降低。其中VdxyL3受海岛棉根系分泌物诱导后表达量明显升高,表明该基因的表达明显受海岛棉根系分泌物的诱导。HIGS研究结果表明,接菌14 d和21 d后转化VdxyL3基因干扰片段的棉花发病明显较重,其病情指数(33.3和83.9)明显高于空载体对照(21.7和66.1)。qRT-PCR分析发现转化VdxyL3基因干扰片段的棉花植株茎中VdxyL3的表达量明显低于空载体对照,真菌生物量显著多于对照。【结论】利用HIGS技术将VdxyL3基因沉默后,棉株的抗病性明显降低,表明VdxyL3在大丽轮枝菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。

【目的】MYB（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）转录因子MoIsw2对稻瘟病菌的生长发育和致病性至关重要。为了深入理解MoIsw2的作用机制，对其调控的稻瘟病菌基因进行鉴定和功能分析。【方法】对野生型稻瘟病菌菌株Ku80和突变体ΔMoisw2进行RNA-seq分析，选择突变体中表达发生明显变化的7个基因（MoEGH16L1、MoEGH16L2、MoSTART1、MoGH61A、MoCTR1、MoFRO1和MoGH31A）作为MoIsw2的候选调控基因，通过基因敲除对其表型和致病性进行分析。【结果】RNA-seq分析表明，突变体ΔMoisw2中差异表达的基因主要涉及氧化还原、细胞膜合成、氨基酸代谢和基因组DNA修复等过程。7个候选调控基因的敲除试验表明，这些基因在稻瘟病菌的营养生长、孢子发育和致病过程中发挥重要作用，各基因突变体表型与突变体ΔMoisw2均具有相似之处。【结论】MoIsw2通过调控多个靶基因参与稻瘟病菌的生长发育和致病过程。

波卓霉素是从波卓链霉菌（Streptomyces bottropensis）中分离得到的，具有抗革兰氏阳性菌及支原体的生物活性，尤其重要的是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和抗万古霉素肠球菌有抑菌活性。试验通过构建基因组文库，PCR筛选获得包含完整波卓霉素合成基因簇的柯斯质粒4E11，通过接合转移的方法把4E11转化至天蓝色链霉菌M145中，对获得的异源表达株M145/4E11进行发酵，通过提取纯化和HPLC-MS检测，表明M145/4E11发酵液中产生了波卓霉素；试验并通过Red/ET重组系统，以红霉素启动子（ermE*P1）替换了波卓霉素生物合成簇抗性基因btmA和前提肽合成基因btmD的启动子...

[目的]本文旨在对前酪氨酸脱水酶(ADT)基因家族进行鉴定,分析其进化过程、基因结构、保守功能域、共线性关系和表达特性,并对梨ADT在石细胞形成过程中的功能进行初步验证。[方法]基于已公布的20个物种全基因组数据,采用BLASTp和Hmmer结合的方法进行成员鉴定,通过多种生物信息学手段分析序列。利用转录组数据和RT-qPCR检测梨ADT成员在果实发育中各个阶段的表达模式。利用农杆菌介导的瞬时转化法在梨幼果中过量表达PbADT1基因,通过间苯三酚染色观察幼果石细胞团分布,并测定木质素含量及其通路基因的表达量。[结果]在20个物种中共鉴定了113个ADT家族成员。通过系统进化树将家族成员分为4个亚组,6个水生藻类中都仅有1个ADT基因被鉴定,随后进化出的陆生植物中ADT基因家族均得到了不同程度的扩张。梨果实发育的转录组数据表明,多个ADT基因的高水平表达集中在花后35 d, RT-qPCR的结果证实了这一点。PbADT1的瞬时过量表达使梨幼果石细胞和木质素含量增加,并提高了木质素关键合成酶的表达水平。[结论]ADT基因在植物从水生向陆生进化的过程中得到了大量扩张,其蛋白水解酶生成的苯丙氨酸是合成木质素和形成维管束的底物基础。梨石细胞在幼果发育期大量形成,ADT在梨中的表达模式表明该基因家族可能调控果实石细胞的形成,PbADT1在梨果实中的瞬时过量表达使木质素含量升高、石细胞扩散加剧,表明ADT基因的过表达可能通过提高关键合成酶的表达水平对梨石细胞的形成产生影响。