【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)CDK11与RNPS1和9G8的相互作用,为解析其是否参与前体RNA的剪接打下基础。【方法】利用家蚕基因组数据库Silk DB找到本研究克隆的家蚕基因序列,采用Primer 5.0进行引物设计,通过PCR技术克隆获得家蚕的两个重要剪接因子RNPS1和9G8,并构建具有不同抗原标签的过表达载体,采用NCBI检索并获得其他物种的相关序列,利用在线预测软件SMART进行结构域预测,采用Clustal X 1.83和GENEDOC 3.2预测同源序列,利用软件MEGA 6

【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术(LC-MS/MS),首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用α-Flag抗体孵育,immunoblotting(IB)再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。

【目的】ｂＨＬＨ转录因子ｂｍｄｉｍｍ是家蚕（ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）５龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现ｂｍｄｉｍｍ蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基Ｋ４３，因此推测ｂｍｄｉｍｍ可能发生泛素化修饰而被降解。ｂｍｃＨｉｐ属于家蚕泛素连接酶Ｅ３家族中的Ｕ－ｂｏｘ亚家族，在家蚕５龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确ｂｍｄｉｍｍ与ｂｍｃＨｉｐ之间的相互作用，以便于更好地理解ｂｍｄｉｍｍ在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析ｂｍｄｉｍｍ和ｂｍｃＨｉｐ在后部丝腺中的表达情况；分别通过ｐｃｒ和基因合成获得ｂｍｄｉｍ．．．

以豆科植物百脉根为材料,构建了AD-cDNA表达文库。其库容量达到每3μg DNA 2×106酵母转化子,空载率为12.5%,平均片段长度为1.5 kb。以百脉根结瘤因子受体激酶基因1(nod factor receptor kinase,NFR1)蛋白激酶结构域的DNA片段(NFR1-PK)为诱饵,利用酵母双杂技术,筛选与NFR1相互作用的基因。结果在含X-gal的四缺选择性培养基上筛选到120个克隆。经质粒抽取、PCR鉴定、回转酵母验证得到80个阳性克隆。对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析,通过NCBI数据库比对分析鉴定含有JAB1、AT-RICH结构域等4个与NFR1-P...

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白ＶＰ５６与宿主蛋白的相互作用，实验采用酵母双杂交Ｇａｌ４系统鉴定与ＶＰ５６相互作用的草鱼蛋白。首先利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从Ⅱ型ＧＣＲＶ感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因ＶＰ５６，构建Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６诱饵表达载体；在酵母菌株中检测其自激活性后，以ＶＰ５６为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株，并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼ＪａＭ－ａ（ＧＣ ＪａＭ－ａ）基因，并构建Ｐ ＧａＤＴ７－ＧＣ ＪａＭ－ａ载体，在酵母中研究草鱼ＧＣ ＪａＭ－ａ与病毒蛋白ＶＰ５６相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６无自激活作用，可以应用于酵母双杂．．．

【目的】Ｈｉｐｐｏ信号通路中的核心激酶通过磷酸化作用于转录共激活因子Ｙｋｉ来调控下游基因的表达，在控制器官大小、细胞增殖与凋亡等方面起关键作用。家蚕（ＢｏｍＢＹｘ ｍｏｒｉ）作为鳞翅目模式昆虫，对其Ｈｉｐｐｏ通路研究较少。论文旨在通过鉴定家蚕ＢｍＹｋｉ－１并对其序列信息和表达特征进行分析，为进一步研究中肠中Ｈｉｐｐｏ信号通路提供基础，更好地了解Ｈｉｐｐｏ信号通路在肠道稳态维持及组织损伤修复方面的调控机制。【方法】利用ＮＣＢｉ数据库及家蚕基因组数据库等相关信息，以哺乳动物和果蝇的Ｙｋｉ蛋白序列为依据，对家蚕Ｙｋｉ基因的同源序列进行鉴定；以家蚕大造品系为研究材料，利用ｐＣｒ和Ｃ ＤＮＡ末端快速克隆．．．

【目的】细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白(Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP)的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。【方法】利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。【结果】通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmpp5的表达量显著下调,表明Bmiap能够促进Bmpp5的表达;同时,过表达Bmpp5后,Bmiap显著上调表达,而敲除Bmpp5后,Bmiap显著下调表达,表明Bmpp5同样能够促进Bmiap的表达;过表达Bmpp5能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmpp5能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmpp5的表达利于BmNPV的增殖。【结论】鉴定了1个能够与BmIAP相互作用的蛋白BmPP5,且该蛋白在昆虫中高度保守;在BmNPV侵染过程中,Bmiap和Bmpp5能够相互促进,且Bmpp5能够促进BmNPV的复制增殖。

为探究石金钱龟板来源的寡肽KNGP能否作为COX-2（环氧合酶-2）的新型抑制剂，通过紫外分光光度法测定石金钱龟板肽YPTP、合成肽段KNGP和RG的IC_(50)值，利用内源荧光、同步荧光、三维荧光光谱和ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)荧光探针法分析KNGP对COX-2的疏水性影响，利用分子对接方法分析KNGP与COX-2间的相互作用方式。结果显示，YPTP、KNGP和RG的IC_(50)值分别为0.609、0.046和0.056 mg/mL,KNGP的IC_(50)值低于阳性药布洛芬（IC_(50)=0.217 mg/mL），说明KNGP对COX-2具有显著的抑制潜力。内源荧光结果显示KNGP对COX-2的作用为静态猝灭且有单一作用位点，同时热力学参数计算结果显示，KNGP和COX-2的结合过程中疏水作用是主要驱动力，且KNGP和COX-2结合的是由熵驱动的自发过程。同步荧光、三维荧光光谱和荧光探针结果显示COX-2中的酪氨酸与色氨酸的疏水环境发生变化，且其表面的疏水性减弱。KNGP与COX-2的分子对接显示，KNGP分子主要通过NH基团、C=O结构、吲哚和咪唑结构与COX-2活性中心的氨基酸残基形成氢键和疏水相互作用，并通过形成静电作用增强结合的稳定性。以上结果表明，KNGP能与COX-2的单一位点通过氢键和疏水相互作用结合形成复合物，并改变酶的二级结构来抑制其活性。

小黑杨ＰｓｎＷＲＫＹ７０是能够响应盐胁迫的转录因子。为了进一步探究该转录因子在参与盐胁迫应答途径中与哪些蛋白质之间存在相互作用关系，本研究以１４０ ｍｍｏｌ／ｌ ｎａ Ｃｌ溶液处理过的小黑杨叶片为材料，利用热稳定核酸酶（Ｄｓｎ）构建了均一化的ＰＧａＤＴ７－ＤＥｓＴ酵母双杂交ＣＤｎａ文库，将ＰｓｎＷＲＫＹ７０基因亚克隆至ＰＧＢＫＴ７载体，形成ＢＤ－ＷＲＫＹ重组质粒，并以之为诱饵蛋白表达载体筛选小黑杨酵母双杂交ＣＤｎａ文库。经过２轮酵母双杂交筛选以及回转验证试验，初步选出了５种与ＰｓｎＷＲＫＹ７０相互作用的蛋白质。对所筛选出的５种蛋白质进行保守结构域分析发现：有２种预测蛋白（ＨＰ１和ＨＰ２，其中Ｈ．．．

【目的】ｍｉｃｒｏ ｒＮＡ是一类长约２２个碱基的非编码ｒＮＡ，通过与其靶基因的特异性结合来调控新陈代谢和生长发育等多种生命活动。鉴定家蚕（ＢｏｍＢｙｘ ｍｏｒｉ）ＢｍｈＡｉｒｙ，比较ＢｍｈＡｉｒｙ和Ｂｍｏ－ｍｉ ｒ－７的表达模式，验证ＢｍｈＡｉｒｙ是否为Ｂｍｏ－ｍｉ ｒ－７的靶基因，为研究家蚕的变态发育机制提供线索。【方法】用家蚕胚胎反转期的总ｒＮＡ反转录合成的ｃ ＤＮＡ模板，克隆ＢｍｈＡｉｒｙ编码区（ｃｏＤｉＮｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅＮｃｅ，ｃＤｓ）和３′端非翻译区（３′ｕＮｔｒＡＮｓｌＡｔｅＤ ｒｅｇｉｏＮ，３′ｕｔｒ）并进行序列分析。基于荧光定量Ｐｃｒ和芯片数据比较Ｂｍｏ－ｍｉ ｒ－７和Ｂ．．．

【目的】鉴定、克隆家蚕(Bombyx mori)glial cell missing(BmGcm)基因,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究BmGcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmGcm全长c DNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对BmGcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和qR

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发生自身相互作用形成寡聚体,本研究通过逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域。【方法】利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation)技术和荧光定位(

【目的】在个体和细胞水平上探讨家蚕(Bombyx mori)BmCaspase-8-Like(BmCasp8L)的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫负调控机制提供参考。【方法】通过RT-PCR技术克隆BmCasp8L并进行结构域预测和进化分析;利用荧光定量PCR检测BmCasp8L在家蚕各龄期、5龄第3天及预蛹期各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征;合成用于RNAi的dsRNA,通过注射dsRNA在个体中降低BmCasp8L的表达水平,并检测对抗菌肽基因表达水平的影响;构建BmCasp8L的细胞表达载体,通过质粒或dsRNA的转染在BmE细胞中过表达BmCasp8L或降低BmCasp8L的表达水平,并利用Western blot或定量PCR予以确认,同时检测抗菌肽基因表达水平的变化及转录因子BmRelish的切割。【结果】BmCasp8L与鳞翅目Caspase-6、哺乳动物Caspase-8同源,其序列与BmDredd、DmDredd N端分别具有61%、42%的相似性,但缺少C端的Caspase结构域。时空表达特征分析表明,BmCasp8L在眠蚕期表达量高于起蚕期,在预蛹期、蛹第7天、蛾第1天表达量明显升高;在5龄第3天幼虫体内,BmCasp8L在血细胞中的表达量明显高于其他组织,而在预蛹期,BmCasp8L主要在丝腺中表达。免疫诱导表达谱显示,5龄第3天家蚕在注射感染黑胸败血芽孢杆菌或粘质沙雷氏菌1 h内,BmCasp8L的表达水平上升,此后逐渐恢复正常。对5龄第2天家蚕注射dsCasp8L或dsEGFP,24 h后通过荧光定量PCR检测到BmCasp8L的表达量在注射dsCasp8L的家蚕中显著下调,而抗菌肽BmCecropinA1的表达水平显著上调。在BmE细胞中过表达BmCasp8L,抗菌肽BmCecropinA1的表达水平与对照相比显著降低,且转录因子BmRelish的切割受到抑制。在细胞中转染dsRNA后,BmCasp8L的表达水平被有效降低,抗菌肽BmCecropinA1的表达水平显著上调。【结论】进化分析、表达特征以及细胞和个体上的功能研究表明BmCasp8L是一个具有免疫负调控作用的分子,通过抑制BmRelish的切割,抑制抗菌肽的表达,从而负调控Imd信号通路,降低BmCasp8L的表达水平则导致抗菌肽表达水平升高,有助于家蚕抵御微生物病原的侵染。

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘。本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家族转录因子结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2在体外体内均可以相互作用,并将相互作用的位点定位在NSP1的GRAS结构域的LHRII区域和NSP2的LHRI区内。

对中国蚕业研究所选育的家蚕品种871C×872C进行了BmNPV攻毒饲养试验。结果表明,871C×872C在同浓度添食病毒条件下,全龄死亡率明显小于对照品种,其半致死浓度(LC50)为109,较对照品种提高了4,5个数量级,抗BmNPV能力显著。