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[期刊] 中国农业科学
[作者]
苏晶晶 陈思源 张奎 余霜 李钰添 梁航华 赵羽卒 晁会娟 崔红娟
【目的】克隆家蚕(Bombyx mori)蛋白酶O基因Cathepsin O(Bm Cat O),分析其m RNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长c DNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E.coil表达菌株Rosetta(DE3),经IP...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
潘光照 张奎 李重阳 赵羽卒 申利 徐曼 苏晶晶 林西 崔红娟
【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6
[期刊] 中国水产科学
[作者]
麻建军 张殿昌 崔淑歌 姜晶晶 蒲含林 江世贵
为了研究合浦珠母贝(Pincatada fucata)的先天免疫调控机制,利用cDNA文库筛选和重测序技术克隆了1个合浦珠母贝组织蛋白酶L的全长cDNA序列(命名为poCL2)。poCL2cDNA全长1094bp,5′-非编码区(Untranslated region,UTR)长21bp,3′-UTR长80bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为993bp,编码330个氨基酸组成的多肽链,分子量为37.1kD,理论等电点为6.9。poCL2蛋白由信号肽(Met1-Ala16)、前体域(Arg17-Asp113)和成熟域(Leu114-Val330)三部分组成,存在一个...
关键词：
合浦珠母贝 组织蛋白酶L 先天免疫
[期刊] 水产学报
[作者]
彭扣 胡蓓娟 赵大显 王军花 盛军庆 吴娣 史建伍 洪一江
为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶Ｌ的亚型及其亚型的免疫相关作用，本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长ｃ ＤＮＡ文库，筛选获得与之同源的ＥＳＴ序列，结合ＲＡｃＥ技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶Ｌ基因的ｃ ＤＮＡ全长，命名为ＨＳ ｃＴＳ Ｌ１－ＬｉｋＥ基因（ＧＥＮ ＢＡＮｋ登录号为ｋＦ０１５２７３）。该序列全长为１２８０ Ｂｐ，５′－非翻译区（５′ＵＴＲ）为３１ Ｂｐ，３′－非翻译区（３′ＵＴＲ）为２５６ Ｂｐ，开放阅读框区（ＯＲＦ）为９９３ Ｂｐ，编码３３０个氨基酸，预测蛋白相对分子量为３６．８６ ｋＵ，理论等电点为６．２３。序列分析结果显示，ＨＳ ｃＴＳ Ｌ１－ＬｉｋＥ与其他软体动物相对．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵洁 梁爱华 付月君
为了研究Bm K IT提高Ac MNPV抗虫活性的作用机制,将Bm K IT基因插入到Ac MNPV中形成重组病毒。采用重组单价病毒Ac MNPV-Bm K IT(IE1)、Ac MNPV-Bm K IT(P10)、Ac MNPV-Bm K IT(PH)和一种重组双价病毒Ac MNPV-Bm K IT(P10)-vcath(PH),通过四唑盐比色法(MTT)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析了Bm K IT在Ac MNPV的3个启动子调控下对Sf9细胞增殖和细胞凋亡的影响,结果显示,感染病毒36,48 h Bm K IT在不同启动子调控下表达量从高到低依次为PH、P10、IE1。同...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵洁 梁爱华 付月君
为了研究Ｂｍ Ｋ ＩＴ提高Ａｃ ｍＮＰＶ抗虫活性的作用机制，将Ｂｍ Ｋ ＩＴ基因插入到Ａｃ ｍＮＰＶ中形成重组病毒。采用重组单价病毒Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（ＩＥ１）、Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（Ｐ１０）、Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（ＰＨ）和一种重组双价病毒Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（Ｐ１０）－ＶｃＡＴＨ（ＰＨ），通过四唑盐比色法（ｍＴＴ）和蛋白质印迹法（ＷＥｓＴＥｒＮ ＢｌｏＴ）分析了Ｂｍ Ｋ ＩＴ在Ａｃ ｍＮＰＶ的３个启动子调控下对ｓｆ９细胞增殖和细胞凋亡的影响，结果显示，感染病毒３６，４８ Ｈ Ｂｍ Ｋ ＩＴ在不同启动子调控下表达量从高到低依次为ＰＨ、Ｐ１０、ＩＥ１。同．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李建伟 李懿 周小英 黎治浪 陈世达 田莎 侯勇 夏庆友
【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)半胱氨酸蛋白酶抑制剂,并对其表达特征及调控进行分析,为深入研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在家蚕变态发育中的作用提供数据支持。【方法】根据家蚕基因组数据库和Primer 5.0软件设计BmCPI40去信号肽引物,对家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂BmCPI40进行克隆,利用Clustal X和MEGA4.0软件对BmCPI40进行氨基酸序列和进化关系分析。采用原核表达系统对重组的BmCPI40进行表达、纯化和抗体的制备。运用RT-PCR和q PCR技术在核酸水平分析BmCPI40时空表达特征,利用Western和免疫荧光技术分别对BmCPI40进行蛋白水平检测和组织定...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
袁新程 施永海 徐嘉波 于爱清 邓平平 张之文 蒋飞
为探明美洲鲥(Alosa sapidissima)雌鱼发育后期卵巢内营养物质的变化规律，提高卵子受精率，采用生化分析、酶联免疫吸附及荧光定量PCR等方法，对性腺发育期Ⅳ期和Ⅴ期的卵巢内氨基酸、脂肪酸、卵黄蛋白原（VTG）和组织蛋白酶D（CTSD）含量及其mRNA表达量进行对比分析。结果显示，Ⅳ期卵巢中水分含量(75.73%)显著低于Ⅴ期(90.64%)(P<0.05)，而粗蛋白含量(16.07%)、粗脂肪含量(2.86%)和粗灰分含量(1.28%)均显著高于Ⅴ期 (5.83%、1.25%、0.81%)(P<0.05)。在Ⅳ、Ⅴ期卵巢内各检测出18种氨基酸，其中谷氨酸含量最高(8.64%和8.13%)；8种必需氨基酸中，Ⅳ期苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸含量均显著高于Ⅴ期 (P＜0.05)，且二者第一限制氨基酸均为色氨酸；Ⅳ期氨基酸总量(TAA)、半必需氨基酸(HEAA)和非必需氨基酸总量(NEAA)均显著高于Ⅴ期(P＜0.05)。两期卵巢内共检测出19种脂肪酸，Ⅳ期C17:0、C20:1n9、C20:4n6和C20:5n3含量显著高于Ⅴ期(P＜0.05)；其中∑MUFA、∑PUFA、∑UFA、∑n3PUFA和EPA+DHA含量均大于Ⅴ期，∑UFA (70.54%)达到显著性差异(P＜0.05)。Ⅳ期卵巢中VTG含量高于Ⅴ期，但不显著(P＞0.05)；而Ⅳ期卵巢中CTSD含量明显比Ⅴ期低 (P＜0.05)。Ⅴ期卵巢VTG 基因表达量是Ⅳ期的13.88倍(P＜0.05) ；而Ⅴ期肝脏内VTG 基因表达明显低于Ⅳ期(P＜0.05)，是Ⅳ期的25%。从Ⅳ期至Ⅴ期，卵巢中CTSD mRNA表达出现下调，肝脏中CTSD mRNA表达出现上调，但均不明显。因此，当前养殖条件下，美洲鲥雌鱼亲本后期发育过程中，卵巢内营养物质积累不均衡，建议适当调整饲料配方，提高限制性氨基酸色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及含量较低的赖氨酸、苏氨酸比例和调高多不饱和脂肪酸C20:3n6、C20:4n6(AA)、C22:6n3(DHA)和C20:5n3(EPA)比例，降低C18:2n6c的比例，保证卵巢后期发育所需营养的均衡。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘丽华 沈卫德 李兵 秦佳梅 刘涛
【目的】研究家蚕细胞周期蛋白家族基因（ＣｙＣｌｉｎＡ、ＣｙＣｌｉｎＢ、ＣｙＣｌｉｎＢ３、ＣｙＣｌｉｎＥ、ＣｙＣｌｉｎｌ１）在滞育卵与即时浸酸处理的滞育卵发育过程中的转录活性，为家蚕胚胎发育及细胞周期调控机制研究提供参考。【方法】以家蚕品种大造为试材，取产后１～８ｄ的滞育卵及产后２０ｈ即时浸酸的非滞育卵，提取其ＲｎＡ反转录成ＣｄｎＡ，采用实时荧光定量ＰＣＲ方法分析家蚕ＣｙＣｌｉｎ家族基因在胚胎发育过程中的转录水平。【结果】在即时浸酸处理的家蚕非滞育卵中均能检测到ＣｙＣｌｉｎ家族基因的表达，但不同发育阶段ＣｙＣｌｉｎ家族基因表达量差异很大，在发育开始的１～３ｄ，ＣｙＣｌｉｎ家族基因变化显著，说明此．．．
关键词：
家蚕 细胞周期蛋白 胚胎发育 基因表达谱
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘丽华 沈卫德 李兵 王文兵
【目的】研究家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1)在丝腺及其他组织中的表达情况,为探讨细胞周期蛋白家族基因在细胞周期中的作用提供参考。【方法】取家蚕5龄3d幼虫的脑、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、精巢、卵巢及血液等组织,用Trizol提取各组织的总RNA并反转录合成cDNA。以Actin3为内参基因,合成的cDNA为模板,利用每个基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR,检测细胞周期蛋白家族基因在转录水平上的表达情况。【结果】在丝腺中,CyclinE基因的表达量最高,CyclinA、CyclinL1基因表达较弱,而Cyclin...
关键词：
细胞周期蛋白 丝腺 表达谱 家蚕
[期刊] 中国水产科学
[作者]
卜兴江 仉晓文 孙允东 赵小凡 王金星
组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了组织蛋白酶L基因,为了进一步研究组织蛋白酶L的组织分布及其功能,对该基因进行了重组表达。将中国明对虾组织蛋白酶L基因的酶原片段亚克隆进原核表达载体pET30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,其分子量在40kD左右,与期望的中国明对虾组织蛋白酶L的分子量一致。表达产物形成包涵体,经过对包涵体变性和复...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李树红 陈志光 李冉 李新 李松 陈秀华 蒋然然 李美良 马璐阳
对原核表达的重组建鲤组织蛋白酶L(Cathepsin L,CAT L)蛋白进行尿素洗涤和Ni-NTA亲和层析纯化,该目的蛋白经300 mmol/L咪唑洗脱为单一峰,SDS-PAGE结合TSK-GEL G2000SWxl凝胶过滤高效液相色谱分析表明重组CAT L获得了高度纯化,分子量约28 k D,纯度超过95%。Z-Phe-Arg-MCA底物测活法显示该重组CAT L表现为半胱氨酸蛋白酶活性,能与其内源抑制因子Cystatin以1︰1的摩尔比结合,具有生物学活性。以纯化的重组CAT L蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗血清,经ELISA法检测获得的CAT L抗血清效价高于1︰512000;West...
[期刊] 水产学报
[作者]
吴东蕾 左迪 黄有辉 马长安 赵云龙
为深入了解红螯光壳螯虾组织蛋白酶L基因的表达特性及维生素C对其表达的影响,实验利用RACE-PCR技术及荧光定量PCR技术,从红螯光壳螯虾肝胰腺中克隆得到组织蛋白酶L基因cDNA全长序列,命名为CqCatL(GenBank登录号:KJ913663),同时检测了该基因在红螯光壳螯虾各个组织及添加了不同浓度维生素C的组别中的表达。结果显示,该基因全长1 810 bp,开放阅读框长度为1 026 bp,编码341个氨基酸残基,预测的分子量和等电点(pI)分别为37.63 ku和5.17。同源性分析结果显示,该基因编码的蛋白与其他虾蟹类有较高的相似性,说明组织蛋白酶L基因在甲壳动物具有较高的保守性。组...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李游山 赵萍 董照明 邹勇 夏庆友 向仲怀
【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
高坤 邓祥元 朱峰 汪生鹏 钱荷英 郭锡杰
【目的】从体外表达家蚕中新发现的1个免疫球蛋白超家族成员—类胰岛素相关肽结合蛋白2(BmIBP2),并制备其多克隆抗体,为进一步深入研究BmIBP2的生物学功能奠定基础。【方法】以家蚕中肠的总cDNA为模板,利用普通PCR方法,扩增出BmIBP2基因的成熟肽序列;通过构建重组表达质粒pET-28a-BmIBP2对BmIBP2的成熟肽进行重组表达;制备多克隆抗体,通过免疫共沉淀的方法研究BmIBP2蛋白的组织特异性。【结果】SDS-PAGE电泳分析表达产物发现,重组蛋白rBmIBP2主要以包涵体的形式表达,目的蛋白大小约为30 kD;以兔抗His-tag抗体为一抗进行Western blot检测...
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