【目的】从体外表达家蚕中新发现的1个免疫球蛋白超家族成员—类胰岛素相关肽结合蛋白2(BmIBP2),并制备其多克隆抗体,为进一步深入研究BmIBP2的生物学功能奠定基础。【方法】以家蚕中肠的总cDNA为模板,利用普通PCR方法,扩增出BmIBP2基因的成熟肽序列;通过构建重组表达质粒pET-28a-BmIBP2对BmIBP2的成熟肽进行重组表达;制备多克隆抗体,通过免疫共沉淀的方法研究BmIBP2蛋白的组织特异性。【结果】SDS-PAGE电泳分析表达产物发现,重组蛋白rBmIBP2主要以包涵体的形式表达,目的蛋白大小约为30 kD;以兔抗His-tag抗体为一抗进行Western blot检测...

【目的】克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白。【方法】以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT-PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1表达载体在BL21(DE3)系统中进行原核表达,使用GSTrapFF预装柱进行纯化并切去标签。【结果】克隆了命名为HarmPBP2(GenBank登录号:EU647241)的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457bp,编码149个氨基酸残...

利用RACE-PCR技术,从牙鲆肝脏组织总RNA中克隆得到胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1)基因的全长cDNA序列,该cDNA全长为1 070 bp,开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸。通过系统进化树分析,牙鲆IGFBP-1与鱼类IGFBP-1基因紧密聚为一支;通过同源性比对,牙鲆IGFBP-1基因的核苷酸序列与大菱鲆同源性最高,为95%,而其推导的氨基酸序列与其它鱼类如大菱鲆、五条、黄金鲈、红点鲑、鲤和斑马鱼的同源性分别为89%、89%、84%、79%、67%和67%。半定量RT-...

为研究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)的特征,阐明IGFBP1基因在不同性别黄颡鱼组织中的表达特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉中的表达差异,克隆IGFBP1基因的c DNA全长,并进行实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析。结果表明:黄颡鱼IGFBP1基因c DNA全长为1 259 bp,其开放阅读框长度为714 bp,编码237个氨基酸,3'端和5'端非翻译区分别为407 bp和138 bp;黄颡鱼IGFBP1基

应用RT-PCR方法扩增七带石斑鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ(esIGF-Ⅰ)成熟肽序列。该成熟肽序列由210个碱基组成,编码70个氨基酸,包括B-C-A-D 4个结构域。将此成熟肽片段导入原核表达载体pET-28a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小为11 ku,在IPTG诱导后3 h表达量最高,占菌体总蛋白的51.8%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。对重组蛋白进行变性、纯化和复性,获得了纯化的重组蛋白。Western-blotting免疫印迹分析表明,融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。细胞增殖实验表明,纯化的IGF-Ⅰ...

【目的】克隆家蚕(Bombyx mori)蛋白酶O基因Cathepsin O(Bm Cat O),分析其m RNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长c DNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E.coil表达菌株Rosetta(DE3),经IP...

根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Güther)类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-I)基因的cDNA序列,设计引物扩增编码IGF-I成熟肽序列,此序列由210个碱基组成,包括B-C-A-D 4个功能域。利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28a上,得到重组质粒,将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析获得的多肽,结果表明:IGF-I融合蛋白大小为11.4 kD,IPTG诱导3 h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的58.5%,1 L菌液表达目的蛋白40.7...

在鱼类胚胎发育过程中,胰岛素样生长因子-II(insulin-like growth factors-II,IGF-II)起着关键的作用。本研究根据Gen Bank收录的鲑鳟鱼IGF-II基因序列设计引物,以哲罗鱼(Hucho taimen)肝RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出哲罗鱼IGF-II基因开放阅读框。将目的基因IGF-II与原核表达载体p SUMO连接构建出重组表达载体p SUMO-IGF。将该重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,约在40 k D处含有清晰的条带,与预期结果相符;目的蛋白以包涵体形式存在。对包涵体进行...

为探讨饲料中不同蛋白源(菜籽粕、发酵豆粕、鸡肉粉、肉骨粉)替代50%鱼粉对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生长、消化酶活性及生长轴基因表达的影响。以克氏原螯虾(9.84±0.49)g为研究对象,将其分为5组(对照组、菜籽粕组、发酵豆粕组、鸡肉粉组、肉骨粉组),分别投喂不同蛋白源的实验饲料,养殖周期6周。结果显示:发酵豆粕组的增重率最高,但与对照组差异不显著;菜籽粕组的增重率显著低于对照组。发酵豆粕组、鸡肉粉组和肉骨粉组的肝胰脏蛋白酶活性与对照组差异不显著,菜籽粕组肝胰脏蛋白酶活性显著性低于对照组;发酵豆粕组脂肪酶活性最高,但与对照组差异不显著。发酵豆粕组小肠的胰岛素生长因子受体(IGF1R)相对表达量与对照组差异不显著,但显著高于其他三组;菜籽粕组、发酵豆粕组和肉骨粉组肝脏的IGF1R相对表达量显著高于对照组。结果表明:比较4种蛋白源替代50%鱼粉,发酵豆粕效果最佳,肉骨粉和鸡肉粉次之,菜籽粕最差。

克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)基因的全长cDNA,并对草鱼不同时期的胚胎和成鱼不同组织进行了RT-PCR分析,以探索草鱼IGFBP-1基因的生物学功能。结果显示:(1)草鱼IGFBP-1基因cDNA全长为1 135bp,包含一个789 bp阅读框,编码262个氨基酸残基;草鱼与鲤、斑马鱼、沟鲶、大鳞大麻哈鱼、虹鳟、五条、小鼠和人的IGFBP-1氨基酸序列相似度分别为94%、93%、69%、60%、58%、56%、40%和38%;草鱼IGFBP-1蛋白的N端和C端序列负责与胰岛素样生长因子(IGF)结合,其保守性较高。...

【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,SDS-PAGE和Westernblot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-ZNS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DN...

【目的】微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。【方法】克隆家蚕微孢子虫NbPTP2。利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。【结果】成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近。Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD。IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。【结论】明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。

【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6

【目的】获得苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的全长序列,并在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达,为探明苹果蠹蛾雌雄间的信息素交流机制奠定基础。【方法】提取苹果蠹蛾触角总RNA,利用RT-PCR、3′-RACE和5′TAIL-PCR扩增技术获得CpomPBP2基因的全长序列;通过构建原核表达载体pET28aCpomPBP2对CpomPBP2进行重组表达与检测;并对融合蛋白pET28a-CpomPBP2进行Western blot鉴定及可溶性鉴定。【结果】以苹果蠹蛾触角总RNA为模板合成cDNA第一链,以cDNA为模板经RT-PCR、3′-RACE和5′TAILPCR扩增,得到...