【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种广泛分布的单脂磷酸水解酶,是动物生物代谢过程中重要的调控酶。实验首次克隆了大黄鱼ALP基因cDNA全序列,命名为LcALP,其全长为2 345 bp,开放阅读框为1 629 bp,编码543个氨基酸。实时荧光定量PCR检测发现,LcALP在大黄鱼雌雄各组织中均有表达,其中在眼和头肾的表达量最高,雌性鳃和脑中LcALP表达量显著高于雄性,而在性腺和脾脏中的表达量则显著低于雄性;胚胎发育过程中,多细胞期、囊胚期和原肠期LcALP基因表达水平相对较低,在卵黄栓形成期明显提高,至孵出期达到峰值,而初孵仔鱼期则显著下调;大黄鱼肌肉细胞系...

分离纯化番鸭小肠中碱性磷酸酶,并对其酶促动力学性质进行研究.结果表明:该酶催化磷酸苯二钠水解反应时最适温度为45℃,最适pH为9.72,米氏常数(Km)为4.76 mmol.L-1.Mg2+对碱性磷酸酶活性有明显激活作用;Cd2+浓度小于0.4 mg.L-1时对碱性磷酸酶有激活作用,而浓度高于0.4 mg.L-1时则有抑制作用;Cu2+对碱性磷酸酶活性有明显抑制作用.

【目的】分析家蚕(Bombyx mori)整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验结果显示重组蛋白在Ca~(2+)的存在下对金黄色葡萄球菌具有较强的凝聚作用。细菌清除试验证实重组蛋白可以有效促进机体对外源入侵细菌的清理作用。【结论】整合素β2具有典型的整合素β亚基的结构特征,可能具有识别病原相关分子模式,如LPS和PGN等的能力,通过与细菌的直接结合而实现对入侵病原微生物的凝聚作用,从而增强有机体的免疫能力,推测在家蚕免疫反应中发挥重要作用。

【目的】通过研究棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)感染宿主昆虫后对宿主中肠碱性磷酸酶(ALP)活性与基因表达水平的影响,明确病毒在侵染宿主过程中对宿主昆虫中肠ALP的调控机理。【方法】采用不同剂量的HearNPV感染3龄棉铃虫,测定感染后不同时间昆虫中肠ALP酶活性及其编码基因表达水平,分析病毒感染试虫与未感染健康试虫的ALP活性和编码基因表达水平上的差异。【结果】HearNPV感染后,能够显著抑制ALP的活性,且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关。ALP活性的下降与病毒下调其编码基因ALP的表达水平有关。【结论】HearNPV感染其宿主昆虫的过程中导致宿主ALP活性显著下...

【目的】揭示热应激环境下蛋鸡肠道菌群结构、肠黏膜碱性磷酸酶活性和氨基酸转运载体mRNA表达量的变化机理。【方法】试验选择16周龄济宁百日鸡96只,随机分成对照组((24±1)℃;Ⅰ)和热应激((38±1)℃)组,各组设6个重复,每个重复8只,试验持续14 d。采用16S rDNA的PCR-DGGE技术和实时荧光定量PCR等手段,分析热应激2(Ⅱ)、7(Ⅲ)、14 d(Ⅳ)时,对十二指肠、空肠及回肠内容物菌群多样性和肠黏膜碱性磷酸酶活性以及氨基酸转运载体rBAT、y+LAT1、CATl mRNA基因表达的相对丰度变化规律。【结果】热应激7 d开始各肠段菌群多样性较为丰富,热应激7、14 d时空肠...

为了探讨碱性磷酸酶(ALP)基因在大菱鲆(Scophthatmus maximus)体内的表达情况及在细胞水平上三碘甲状腺原氨酸(T3)对碱性磷酸酶(ALP)基因表达量的影响,利用荧光定量PCR法检测了大菱鲆肠、肌肉、脾脏、心脏、鳃、肝脏、肾脏及脑8个不同组织中ALP mRNA的表达情况,并且用0 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L 5个不同浓度的T3处理大菱鲆肾细胞(SMKC),采用实时荧光定量PCR法测定T3处理后细胞中ALP mRNA的表达情况。结果表明,ALP mRNA在大菱鲆不同组织中的表达量各不相同,具有组织特异性。心脏...

【目的】微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。【方法】克隆家蚕微孢子虫NbPTP2。利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。【结果】成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近。Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD。IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。【结论】明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。

为研究软体动物贝壳发育区形成机制，实验通过扫描电子显微镜观察分析了皱纹盘鲍贝壳发育区的形态特征，鉴定了皱纹盘鲍的酪氨酸酶(Hdi-Tyr1和Hdi-Tyr2)、过氧化物酶(Hdi-Prx1、Hdi-Prx2)和碱性磷酸酶(Hdi-Alp)等5个贝壳形成相关的候选基因，并通过整装原位杂交技术解析了各基因在皱纹盘鲍早期幼虫发育过程中的表达模式。结果显示，皱纹盘鲍贝壳发育区由至少3种特征差异明显的细胞组成，酪氨酸酶基因(Hdi-Tyr1和HdiTyr2)在担轮幼虫的贝壳发育区呈“U”形表达，在面盘幼虫外套膜的长柱状细胞中表达，而碱性磷酸酶(Hdi-Alp)和过氧化物酶(Hdi-Prx1和Hdi-Prx2)基因仅表达在幼虫的担轮环和头部。研究表明，Hdi-Tyr1和Hdi-Tyr2基因可能参与了皱纹盘鲍担轮幼虫和面盘幼虫的贝壳形成过程，而过氧化物酶基因Hdi-Prx1和Hdi-Prx2以及碱性磷酸酶基因Hdi-Alp并不参与初生壳的发育过程，实验结果为深入解析软体动物的贝壳发育机制和贝壳相关性状的种质创新提供了基础支撑。

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术(RLM-RACE)克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列(GenBank登录号:EF428980)。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1047bp,其中780bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6kD,等电点(pI)为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P3.0Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Coc...

　在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。

为进一步研究刺参甘露糖结合凝集素(AJ-MBL)的功能及提高刺参自身免疫力,对AJ-MBL基因的CDS区进行原核表达、纯化并初步鉴定其生物学活性。采用RT-PCR法扩增AJ-MBL基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其CDS区498 bp片段克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET-AJ-MBL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经IPTG诱导表达出分子量约17 ku的融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,用Ni2+离子亲和柱纯化。结果显示,获得高表达量的重组纯化蛋白。纯化的17 ku AJ-MBL进行红细胞凝集试验检测其生物学活性。凝集试验结果显示,AJ-MBL凝集...

磷酸酶普遍存在于动物的各组织中,对磷酸单酯键具有水解活性,是机体生长代谢、保持内环境稳定和维持机体健康所必需的酶。以镜鲤(Cyprinus carpio L.)全同胞家系190个个体为材料,用992对微卫星(SSR)标记进行基因组扫描,采用区间作图法,对肠组织的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶进行了QTL定位分析。QTL检测显示:5个QTL区间与酸性磷酸酶活性相关,其中3个QTL为99%染色体水平显著性,分别位于LG2(CA2049-CA2371)、LG25(HLJ2941-HLJ3946)和LG28(CA2263-HLJ2873),另外两个QTL区间为95%染色体水平显著性,位于LG14(HLJ327...

【目的】克隆家蚕精氨酸激酶基因,分析其基因结构与表达特性,为揭示无脊椎动物体内能量代谢调节规律提供重要基础。【方法】通过分析家蚕EST、利用RACE法和基因组文库筛选法克隆了家蚕精氨酸激酶(BmAK,Bombyx mori arginine kinase)基因,并对其基因结构和表达特性进行了分析。【结果】克隆了BmAK基因,cDNA全长为1 268bp,编码355个氨基酸,具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列,酶活性中心位点氨基酸和能形成离子偶结构氨基酸;该基因由2个外显子和1个内含子组成;5′调控序列存在BRCZ、E74A、FTZ等多个潜在转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列;该...