【目的】分析家蚕(Bombyx mori)整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验结果显示重组蛋白在Ca~(2+)的存在下对金黄色葡萄球菌具有较强的凝聚作用。细菌清除试验证实重组蛋白可以有效促进机体对外源入侵细菌的清理作用。【结论】整合素β2具有典型的整合素β亚基的结构特征,可能具有识别病原相关分子模式,如LPS和PGN等的能力,通过与细菌的直接结合而实现对入侵病原微生物的凝聚作用,从而增强有机体的免疫能力,推测在家蚕免疫反应中发挥重要作用。

【目的】微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。【方法】克隆家蚕微孢子虫NbPTP2。利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。【结果】成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近。Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD。IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。【结论】明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。

【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分

【目的】克隆家蚕整合素基因BmintegrinαPS3,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征,并进行原核表达及蛋白纯化,为进一步探究BmintegrinαPS3在家蚕中的功能奠定基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmintegrinαPS3的cDNA全长序列;采用RT-PCR方法检测BmintegrinαPS3的时空表达;在原核表达系统中表达获得BmintegrinαPS3重组蛋白;并构建BmintegrinαPS3真核表达载体,转染家蚕胚胎细胞系分析其蛋白亚细胞定位。【结果】家蚕整合素基因BmintegrinαPS3编码框全长为2 895 bp,编码965个氨基酸,含有整合素家族蛋白典型的...

通过对半滑舌鳎（Ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｓ ｓｅｍｉｌａｅｖｉｓ）进行全基因组及转录组测序，预测了一个半滑舌鳎性别相关基因ＣｓＦＲ２，目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究ＣｓＦＲ２基因的功能，本研究从蛋白层面入手，构建了原核表达载体ｐ ｅＴ－３２ａ－ＣｓＦＲ２，转化到大肠杆菌ｅ．Ｃｏｌｉ进行诱导表达，用Ｈｉｓ ＴＲａｐ进行蛋白纯化，ｓＤｓ－ｐａｇｅ电泳检测诱导及纯化产物，并将表达纯化的ＣｓＦＲ２蛋白注射１龄半滑舌鳎精巢。由于ＣｓＦＲ２是一个性别相关基因，因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性，本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Ｃｙｐ１９ａ和Ｆｏｘｌ２的表达量变化，来．．．

通过对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)进行全基因组及转录组测序,预测了一个半滑舌鳎性别相关基因CSFR2,目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究CSFR2基因的功能,本研究从蛋白层面入手,构建了原核表达载体p ET-32a-CSFR2,转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,用His Trap进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测诱导及纯化产物,并将表达纯化的CSFR2蛋白注射1龄半滑舌鳎精巢。由于CSFR2是一个性别相关基因,因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性,本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达量变化,来...

【目的】探究家蚕感染BmNPV后,不同组织碱性磷酸酶(ALP)及其基因表达变化规律,为阐明BmNPV的侵染机制及培育抗NPV蚕品种的选育提供借鉴和思考。【方法】通过经口添食BmNPV,检测分析家蚕中肠、血淋巴和脂肪体ALP基因的表达水平及其编码的碱性磷酸酶活性变化情况。【结果】家蚕中肠ALP基因在感染BmNPV后6、9和12 h呈现上调表达趋势,其编码的碱性磷酸酶活性显著高于对照组,在感染24 h基因表达被抑制,同时酶活性显著降低。血淋巴碱性磷酸酶及ALP基因对BmNPV的响应略晚于中肠,ALP基因在感染9 h开始上调表达,在12 h表达量最高,在24 h表达量急剧降低。碱性磷酸酶活性在9和12 h极显著高于对照组,而在24 h急剧减弱,显著低于对照组。脂肪体ALP基因表达量及碱性磷酸酶活性仅在感染12 h显著高于对照组。【结论】家蚕感染BmNPV后,中肠、血淋巴和脂肪体ALP基因表达水平及碱性磷酸酶活性变化均是呈现先升高后急剧减弱的趋势。基因的表达情况与酶活性变化规律一致,这与家蚕感染BmNPV后,其自身机体的生理代谢进程存在紧密联系,暗示碱性磷酸酶在家蚕抗病毒过程中发挥了重要作用。

【目的】在家蚕基因表达谱研究中鉴定了近4万个特异的SAGE标签,为了研究这些标签所对应基因的功能,选择了其中一个SAGE标签,探索这个SAGE标签对应的基因序列,表达特征以及相关的功能。【方法】在SAGE结合GLGI结果的基础上,利用5’RACE获得基因的全长,根据不同物种间该基因的同源性来构建系统发生树,通过PCR检测该基因在家蚕不同时期、不同组织中的表达特征,并在原核表达系统中表达该基因。【结果】从cDNA中获得了家蚕TCTP基因的全长序列,构建了不同物种间TCTP的系统发生树,PCR结果表明TCTP基因在家蚕的各个时期、各个组织中都稳定的表达,并且成功的在原核表达系统中表达了该基因。【结...

【目的】由于LBD基因编码一类植物特有的空间结构尚未解析的转录因子,拟建立2种LBD家族成员(TtRa2和AtLBD37)及其DNA结合结构域的高效表达与纯化体系,为该家族转录因子的结晶研究奠定基础。【方法】以pET-21a表达载体为基架,设计并构建了pHMT载体,该载体在目标基因上游依次融合了His-tag、MBP和TEV蛋白酶酶切位点。将TtRa2和AtLBD37基因的完整编码区及其DNA结合结构域编码区分别插入pHMT载体,获得重组质粒pHMT-AtLBD37、pHMT-AtLBD37-BD、pHMT-TtRa2、pHMT-TtRa2-BD。将上述质粒导入E.coli表达菌株2566诱导...

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6

【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫...

【目的】鉴定、克隆家蚕(Bombyx mori)glial cell missing(BmGcm)基因,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究BmGcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmGcm全长c DNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对BmGcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和qR

【目的】对来航鸡ＦＯＸＬ２基因进行真核表达及纯化，为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ已发表的来航鸡ＦＯＸＬ２基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＦ＿７０８８６８．１）设计引物，以来航鸡全血Ｄｎａ为模板，ＰＣＲ扩增ＦＯＸＬ２基因，经ｅＣＯＲⅠ和ＸＢａⅠ双酶切后定向克隆于ＰＰＩＣＺαａ中，获得ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２真核表达载体。将ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２转化毕赤酵母菌ＧＳ１１５，用甲醇进行诱导表达，对表达产物进行ＳＤＳ－ＰａＧｅ和ＷｅＳｔｅＲｎ ＢＬＯｔｔＩｎＧ检测。【结果】克隆了９１８ＢＰ的ＦＯＸＬ２基因；成功构建了ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２真核表达载体；实现了ＦＯＸＬ２．．．

【目的】在细胞和个体水平上探讨家蚕BmFAF的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫稳态提供参考。【方法】通过RT-PCR技术克隆BmFAF并进行结构域预测和分析;利用荧光定量PCR检测BmFAF在家蚕各龄期以及5龄第3天幼虫的各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征;构建BmFAF的细胞表达载体以及合成用于RNAi的dsRNA,通过质粒或dsRNA的转染在BmE细胞中过表达BmFAF或降低BmFAF的表达水平,并利用Western blotting或定量PCR予以确认,同时检测抗菌肽基因表达水平的变化;通过注射dsRNA在个体中降低BmFAF的表达水平,并检测BmFAF对抗菌肽基因表...