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[期刊] 中国农业科学
[作者]
尤征英 危浩 阮系真 叶露鹏 王少华 周继勇 钟伯雄
【目的】采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统,尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白(RVNP)的技术体系,为生产基因工程疫苗奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列,采用家蚕丝胶蛋白基因(Ser1)启动子为特异性启动子,将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体(pBA3EGFP)中,并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。【结果】G1代通过EGFP标记的筛选获得转基因家蚕阳性蛾区26个,蛾圈阳性率为59.09%。PCR实验证实RVNP已经整合到家蚕基因组中,Western blot分析表明RV...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
钟伯雄 危浩 庄兰芳
综述了基于piggyBac转座子的转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的3个关键环节:(1)外源目的基因高效插入家蚕基因组;(2)转基因家蚕的高效、快捷的检测;(3)具有生物活性的外源目的蛋白的高效表达和纯化。同时介绍了有关转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的研究进展,为更好地利用转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白提供了参考。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 王丽 杨继飞 郅玉宝 滕蔓 邓瑞广 肖治军 张改平
利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。
关键词：
狂犬病病毒 糖蛋白 胞外区 纯化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于春梅 李鹏 郑其升 李斐 苏鑫铭 曹瑞兵 周斌 陈溥言
为了给伪狂犬病病毒(PrV)UL24蛋白的细胞定位和功能研究提供参考依据,据GenBank公布的PrVUL24基因序列(登录号NC006151)设计1对引物,以质粒pUL24-GFP为模板,用PCR方法扩增出部分缺失的基因片段mUL24(modified UL24)。将mUL24片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达载体pET-UL24。阳性质粒转化宿主菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白(His)6-UL24以包涵体的形式获得表达。用纯化后的pET-UL24融合蛋白免疫家兔,ELISA分析表明,在血清效价达到1∶2 560以上,Western-b...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
琚春梅 陈焕春 郗鑫 刘正飞 曹胜波
目的以伪狂犬病病毒为载体,构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒,并研究其生物学特性。方法将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中,构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒,然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。结果利用检测PCV2ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+,同时用Southernblotting证实外源基因PCV2ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验(...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘华伟 李游山 唐新 张晓璐 赵萍
【目的】分析家蚕（ＢｏｍＢｙｘ ｍｏｒｉ）丝氨酸蛋白酶基因ＢｍＳＰ１４１序列信息，明确其时空表达模式，结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响，探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因ＢｍＳＰ１４１进行Ｔ－Ａ克隆，得到其编码区核苷酸序列；应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析；利用ＣｌｕＳＴＡｌ ｘ１．８和ｍＥＧＡ５．０２软件对ＢｍＳＰ１４１与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析；构建原核表达载体Ｐ２８－ＢｍＳＰ１４１，并转化到ｒｏＳＥＴＴＡ（ＤＥ３）菌株中诱导表达，利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量ｒＴ－ＰＣｒ和实．．．
关键词：
家蚕 丝氨酸蛋白酶 中肠 饥饿 表达分析
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏鑫铭 徐亚林 于春梅 曹瑞兵 周斌 陈溥言
根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400μg.mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre。利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达。结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419。将S0419感染已...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
冉智光 童光志 张绍杰 王玉春 黄勇富
根据已发表的伪狂犬病毒（ＰｒＶ）的基因序列，在ＰｒＶｇＥ基因起始密码子和终止密码子的上、下游分别设计一对引物ＰＣＬ１和ＰＣＬ２，在ＰＣＬ１和ＰＣＬ２的５端分别加上ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点，以ＰｒＶＭｉｎ－Ａ株ＤＮＡ为模板成功地扩增到约１．８ｋｂ的片段，经酶切鉴定为ＰｒＶｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物以ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ消化，回收后与经ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ酶解的ｐＵＣ１１９连接、转化，获得了明显大于载体的重组质粒，经限制性酶切和序列部分测定鉴定了阳性重组质粒ｐＲＺＥ。将ｐＲＺＥ分别经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ酶切，回收ｇＥ基因，分别克隆到真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ和杆状病毒载体...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李游山 赵萍 董照明 邹勇 夏庆友 向仲怀
【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜娟 兰文升 刘荭 郑晓聪 陈孝煊
通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清...
[期刊] 水产学报
[作者]
张海强 邵玲
鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
黄伟坚 姜焱 陈德胜 芦银华 张雪莲 陈溥言
应用PCR方法从PRVSH (上海株 )病毒培养物扩增了gG基因 ,克隆入 pcDNA3质粒 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增的 gG基因片段长 1719bp ,包含一个 14 91bp的开放阅读框 (ORF) ,在起始密码子上游有TATAAAA盒 ,在终止密码子下游有AATAAA的 poly (A)尾 ,编码由 4 96个氨基酸组成的蛋白质。与Rice株相应的gG片段相比 ,核苷酸序列同源性达 97 1%。但推导的氨基酸序列同源性仅有 87 6 % ,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸 ,出现了突变和移码 ,导致氨基酸序列同源性降低。gG具有膜蛋白的结构特点。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵盼 唐顺明 刘挺 覃光星 郭锡杰
【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,SDS-PAGE和Westernblot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-ZNS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DN...
关键词：
家蚕 浓核病毒 非结构蛋白 表达 活性
[期刊] 水产学报
[作者]
苏国茂 秦真东 李嘉波 周萌 莫金凤 张凯 梁日深 吴灶和 赵丽娟 林蠡
近年来罗非鱼湖病毒(TiLV)在多个国家流行,对世界罗非鱼养殖业造成严重威胁。中国是罗非鱼第一养殖大国,尽管我国大陆还没有TiLV的正式报道,鉴于吉富罗非鱼是我国重要的罗非鱼养殖品种,其对TiLV的感染特性研究具有重要意义。本实验采用TiLV对吉富罗非鱼进行人工感染,随后在肝脏组织中克隆和测定了TiLV第6片段基因。罗非鱼湖病毒第6片段基因cDNA全长1 044 bp,开放读码框(ORF)为954 bp,编码317个氨基酸,预测分子量为36.38 ku;5′非编码区(NCR)为19 bp,3′非编码区(NCR)为972 bp。系统进化树分析表明该蛋白属于TiLV核蛋白(NP)。随后在大肠杆菌中表达和提纯了GST融合NP蛋白,在新西兰大白兔上制备了多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价为1∶51 200,且抗体可特异性识别感染组织中的病毒NP蛋白。对吉富罗非鱼不同组织进行苏木精—伊红(H.E)染色观察,发现肝脏组织坏死并形成合胞体,脾脏部分细胞出现空泡、坏死,含铁血黄素增多,头肾细胞坏死,鳃丝上皮细胞明显解离脱落,鳃小片黏连,脑组织细胞肿大。通过蛋白印迹法(WB)和免疫组化(IHC)对人工感染TiLV的吉富罗非鱼不同组织进行检测,结果显示,NP蛋白在肝脏、脑、体肾和头肾等组织中均有表达,以肝脏组织中表达量最高。为了解吉富罗非鱼对TiLV的免疫反应,通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测定免疫因子TNF-α和TGF-β在主要免疫器官脾脏和头肾组织中的表达。研究表明,在感染早期(感染后12～24 h),病毒可显著抑制TNF-α和TGF-β在脾脏和头肾中的表达,可能通过抑制宿主这些免疫因子来促进病毒自身早期的复制。本研究将为进一步解读TiLV的致病机理及其高效防控提供理论基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘娜 刘青涛 李银 杨婧 李祥瑞
通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。
关键词：
血清4型禽腺病毒 六邻体蛋白 原核表达
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