探讨宰后鸭肉骨骼肌细胞中是否发生细胞凋亡以及哪些因素对其产生影响,为进一步用细胞凋亡机理阐明水禽类肉的成熟机理提供新的试验依据。分析检测宰后鸭胸肉和腿肉中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达量和线粒体细胞色素-C含量变化、TUNEL法检测阳性凋亡细胞核数量变化以及宰后ATP代谢和pH值变化情况。结果显示,宰后鸭肉骨骼肌中Bax/Bcl-2蛋白表达量比值均显著上调(P<0.05),线粒体细胞色素-C含量均显著降低(P<0.05);ATP含量和pH值在宰后0.5...

【目的】探讨caspase-3在宰后鸭肉中是否被激活以及参与改善宰后鸭肉的嫩度,为进一步用细胞凋亡机理阐明水禽类肉的成熟机理提供新的试验依据。【方法】分析检测宰后鸭胸肉和腿肉胞浆中细胞色素-C含量变化,caspase-3、-8和-9活化片段和酶活力变化、PARP降解片段的表达水平以及宰后鸭肉剪切力的变化情况。【结果】宰后鸭肉骨骼肌胞浆中细胞色素-C含量均显著升高(P<0.05);作为caspase系统的标志性蛋白,胸肉和腿肉中PARP蛋白均被劈开成小片段,且剪切力值于宰后4...

【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分，其生长发育直接影响畜禽肉产量，叉头转录因子O1(forkhead box protein O1, FoxO1)作为重要的转录调控因子，其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用，为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品，提取其RNA并反转录，利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞，通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒，以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达，其在成年牛的背脂中表达量最高，在背最长肌组织中表达量最低，且FoxO1在犊牛背最长肌组织中的表达量要极显著高于成年牛的（P<0.01）。亚细胞定位结果显示FoxO1在牛骨骼肌细胞的细胞核和细胞质内均有表达，其细胞核内荧光强度高于细胞质。成功构建FoxO1过表达载体，并完成FoxO1重组过表达腺病毒的包装与扩繁，在感染牛骨骼肌细胞后，能显著提高FoxO1表达水平（P<0.01）。EdU检测显示过表达FoxO1会显著降低细胞增殖率（P<0.01），流式细胞周期检测显示过表达FoxO1会显著增加G1期细胞数并减少S期和G2期细胞数，抑制细胞G1/S期的转化，并减少G2期细胞的形成。利用qPCR进一步检测发现，增殖相关基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1和CCNE2均极显著下调（P<0.01），促凋亡相关基因BAD和BAX显著上调以及抑凋亡基因BCL2显著下调（P<0.05）。过表达FoxO1导致牛骨骼肌细胞肌管形成量减少，qPCR检测结果发现，骨骼肌分化相关基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表达量显著下调（P<0.05）。【结论】FoxO1在牛的不同组织中均有表达，是一个广泛存在的转录调控因子，并且在背最长肌组织生长发育不同阶段存在表达差异，起到阶段调控作用。FoxO1在细胞核和细胞质中均发挥重要的转录调控作用，特别是在细胞核内。过表达FoxO1可能通过抑制细胞增殖相关基因和肌细胞分化相关基因的表达，从而抑制牛骨骼肌细胞的增殖与分化，并且可能通过上调促凋亡基因的表达和下调抑凋亡基因的表达来促使牛骨骼肌细胞凋亡的发生。

以高邮鸭和金定鸭为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法测定生肌调节因子MyoD1和Myf5基因在不同发育阶段鸭胚(13、15、17、19、21和23胚龄)骨骼肌成肌细胞中的表达水平,分析MyoD1和Myf5基因在鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达模式和差异.结果表明,Myf5和MyoD1基因在胸腿肌成肌细胞中呈现不同的表达规律:胸肌成肌细胞中,Myf5基因的表达呈"低→高→低→较高"的趋势,类似反"∽"形;MyoD1基因的表达呈"低→高→低"的趋势,在金定鸭17胚龄时达到高峰后迅速下降(P0.05)...

【目的】以茶碱为参照,观察中药成分牛蒡子苷对原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)活性及蛋白质合成的影响,探讨中药通过抑制PDE促进肌肉生长的作用及机理。【方法】分离1～3日龄ICR小鼠四肢肌肉用于骨骼肌原代细胞培养,在培养至第5～6天时向培养基中添加不同浓度的牛蒡子苷和茶碱,以不含牛蒡子苷和茶碱的培养基为阴性对照,继续培养24h,采用HPLC、ELISA以及考马斯亮蓝法分别测定骨骼肌细胞cAMP PDE的活性、细胞内cAMP水平以及细胞总蛋白质合成。【结果】牛蒡子苷终浓度达到2.5μg·ml-1、茶碱终浓度为20μg·ml-1时均能极显著抑制原代培养骨骼肌细胞...

［目的］研究支链氨基酸（ＢＣＡＡ）对大鼠骨骼肌细胞蛋白质代谢的影响，探讨氨基酸转运载体在ＢＣＡＡ调控细胞蛋白质代谢途径中的作用机制。［方法］用缺失支链氨基酸（Ｌｅｕ－，ＩＬｅ－，ＶＡＬ－）的无血清高糖型ＤＭｅＭ培养液培养Ｌ６肌管细胞，先后在培养基质中添加１００ ｎＭｏＬ·Ｌ－１雷帕霉素、支链氨基酸（Ｌｅｕ＋，ＩＬｅ＋，ＶＡＬ＋）和胎牛胰岛素，ＲＴ－ＰＣＲ法检测细胞表面氨基酸转运载体ＬＡＴ１、ＣＤ９８和ＳｎＡＴ２以及氨基酸调控因子ＧＣｎ２和ＡＴＦ４ ＭＲｎＡ表达，并结合ＷｅＳＴｅＲｎ－ＢＬｏＴ法考察蛋白合成关键因子磷酸化Ｓ６Ｋ１蛋白表达量及蛋白降解关键因子ＭｕＲＦ１和ＭＡＦＢｘ ＭＲｎＡ表达水平．．．

【目的】卵泡抑素（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积，可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞，阐明ｔＧＦ－β／ｓｍａｄ信号通路在Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化１４ ｄ的鸭胚为试验材料，采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞，待细胞长到７０％—８０％时，将培养基换成含有浓度分别为０、１、１０、１００ ｎＧ·ｍ ｌ－１的Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ培养基，继续培养３６ ｈ后，采用ＣＣＫ－８检测骨骼肌卫星细胞增殖情况；使用抗ｐａｘ７抗体染色，ｄａｐｉ染核，鉴定骨骼肌卫星细胞；采用ｒｅａｌ－ｔ．．．

【目的】卵泡抑素(Follistatin)能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%—80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·m L-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-t...

【目的】探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体(pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a)或LncRNA-133a抑制物(si-LncRNA 133a)转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中(D0-D3),肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时(D2)表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期(D0):与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加(P<0.01),而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少(P<0.01),且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低(P<0.01),同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。

【背景】目前关于褪黑素（melatonin,MLT）的研究多集中在家禽的生殖功能上，而与家禽肌肉发育相关的作用机制却鲜有研究。同时MLT与烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)功能相似且都与昼夜节律相关，研究发现MLT与NMN的单一处理对细胞衰老的影响有限，而共同处理的效果更为显著，虽然二者对线粒体功能和骨骼肌衰老的影响也有相关报道，但在骨骼肌生长发育的作用机制方面尚无可以参考的报道。【目的】通过探究MLT与NMN参与浙东白鹅骨骼肌卫星细胞增殖的分子机制，为其在家禽生产实践中的应用提供思路。【方法】通过解剖鹅胚分离培养鹅骨骼肌卫星细胞，并对骨骼肌卫星细胞的特异性蛋白Pax7和Desmin进行免疫荧光染色以此鉴定细胞，在体外成熟培养基础上用1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN分别单独或组合处理细胞24 h后，利用CCK-8检测细胞活力；为探究MLT如何调控鹅骨骼肌卫星细胞增殖的机制，通过构建MLT受体基因（MTNR1A、MTNR1B）的过表达载体，并与1 ng·mL-1 MLT共同处理细胞，采用qRT-PCR和Western blot实验技术研究过表达MTNR1A、MTNR1B是否影响MLT对增殖基因的促进作用；为了进一步探究MLT与NMN对鹅骨骼肌卫星细胞增殖相关基因的影响，采用qRT-PCR和Western blot实验技术检测骨骼肌细胞增殖相关基因的表达变化。【结果】骨骼肌卫星细胞的特异性标志蛋白Pax7和Desmin分别在细胞核和细胞质中呈绿色荧光的阳性反应，结果表明试验所用细胞为骨骼肌卫星细胞，CCK-8检测结果表示1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN促进鹅骨骼肌卫星细胞活性，qRT-PCR和Western blot结果显示，与对照组相比，过表达MLT受体基因MTNR1A、MTNR1B后，增殖标志基因Pax7的mRNA和蛋白表达显著上调（P<0.05），抑制增殖的标志基因MSTN的mRNA和蛋白表达显著下调（P<0.05），抑制增殖的标志基因MSTN的mRNA和蛋白表达显著下调（P<0.05），其变化比NMN和MLT单独处理更为显著。【结论】MLT通过其受体促进骨骼肌卫星细胞增殖，NMN和MLT共同处理可以加强MLT对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的促进作用，也为MLT和NMN在家禽实际生产中的应用提供了新思路。

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较...

为探讨TR-β基因在不同品种鸭胚胎期和出雏早期胸肌和腿肌中表达的发育性变化及其对胸腿肌重的影响。采用实时荧光定量PCR方法研究了高邮鸭和金定鸭胚胎期(17,21,25,27胚龄)和出雏早期(7日龄)胸腿肌中TR-βmRNA的表达水平。结果表明,TR-β mRNA在2个品种鸭肌肉早期发育中表现出一致的表达规律,但在腿肌和胸肌的发育性变化规律稍有不同:在胚胎期胸肌和腿肌中的TR-β mRNA表达量均呈先低后高的趋势,27胚龄时表达量最高;但出壳后胸肌中的TR-β mRNA表达量出现显著下降(P0.05)。表明TR-βmRNA表达具有显著的胚(日)龄依赖性,...

为探讨L-肉碱与辅酶Q10单独或共同添加时对腹水症肉鸡心肌细胞凋亡的影响,在饲料中添加100 mg/kg L-肉碱和40 mg/kg辅酶Q10,采用常规温度缓慢降温和低温处理。结果表明:日粮中单独添加辅酶Q10可以显著降低低温组肉鸡36日龄时的红细胞压积(PCV)(0.41 vs.0.31)(P<0.05);单独添加L-肉碱或辅酶Q10以及二者同时添加都可以显著降低腹水症的死亡率(P<0.05)。正常肉鸡心肌细胞采用H2O2诱导凋亡时,发现有细胞色素C大量释放到胞浆中,而不采用...

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P<0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。

【目的】ＩＧＦ－Ｉ－钙调磷酸酶（Ｃａ Ｎ）－ＮＦａＴ信号途径是调节肌肉生长、决定不同肌纤维类型的主要信号途径，本研究选择生长速度不同的高邮鸭和金定鸭为试验材料，首次对不同品种鸭胚胎期和出雏早期肌肉中ＩＧＦ－Ｉ－Ｃａ Ｎ－ＮＦａＴ信号通路相关基因的表达规律及其与肌纤维类型的相关性进行了研究。【方法】采用实时荧光定量ＰＣＲ方法研究鸭１３、１７、２１、２５、２７胚龄和出雏后７日龄胰岛素样生长因子（ＩＮｓｕｌＩＮ－ｌＩｋｅ ＧＲｏｗＴｈ ＦａＣＴｏＲｓ，ＩＧＦ－Ｉ），钙调磷酸酶（ＣａｌＣＩＮｅｕＲＩＮ，ＣＮ ａα）和活化Ｔ细胞核因子（ＮｕＣｌｅａＲ ＦａＣＴｏＲ ｏＦ ａＣＴＩｖａＴｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ．．．