为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.83

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。

根据已发表的气单胞菌16SrDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列,设计了2对引物,建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测,发现16SrDNA引物具有高度的特异性,仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97.2%,且具有高度的敏感性,可检测最低1fg的模板。将16SrDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94.4%。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方...

本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips, LFS)相结合的可视化快速检测杀鲑气单胞菌的方法。结果显示:本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法在37℃孵育25 min即可完成,特异性良好,与其他致病菌无交叉反应;灵敏度实验结果显示,该菌的纯培养物和人工污染的鲤鱼组织中的最低检测限均为单次反应1 CFU(colony forming unit)。本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,检测结果可通过肉眼直接观察,操作简单,不依赖昂贵的仪器设备,适用于养殖业中杀鲑气单胞菌的现场检测。

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌，可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种，目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测，针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp. masoucida)，本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息，选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因，根据其序列设计特异性引物，进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度和酶浓度5个方面进行了优化，并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示，2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃，10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO_4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5μL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃，10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO_4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5μL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测，均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA)，对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验，感染后取病鱼组织进行PCR检测，结果显示，本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述，本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检测方法，该检测方法为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的流行病调查和快速诊断提供了支撑。

利用GyrB基因的特异性引物建立沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法。将已知浓度的气单胞菌菌液加入灭菌的沉积物样品中,作为模拟沉积物样品。通过选择和优化沉积物DNA提取方法、特异性引物、标准曲线模板,建立沉积环境中气单胞菌属细菌准确检验的实时荧光定量PCR方法,同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明,采用改进的溶菌酶-SDS温和裂解法提取沉积物DNA,以扩增GyrB基因片段的IAF和IAR为特异性引物,并直接以模拟沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线,可以建立适用于定量检测沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘...

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病...

应用四川省农业科学院分析测试中心实验室建立的转基因玉米NK603结构特异实时定量PCR方法测定含量为2%的转基因玉米NK603样品中结构特异片段的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定了测量的不确定度。结果表明,uA=0.0003,uB=0.001,uC=0.001,U95=0.002,测量结果为1.6%±0.002%。NK603结构特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。

为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。

应用转基因玉米NK603品系特异实时定量PCR方法,测定含量为2%的转基因玉米NK603样品中旁侧片段(品系特异片段)的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定了测量的不确定度。结果表明,u A=0.0008,u B=0.001,u C=0.001,U=0.002,测量结果为1.9%±0.002。NK603品系特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。

针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCAT)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的16SrRNA基因的保守区设计2对特异性引物。通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aeromonasspp.)和嗜水气单胞菌的双重PCR检测方法。用此方法对5株嗜水气单胞菌、7株其他不同种的气单胞菌和5株非气单胞菌属菌株进行双重PCR检测。结果显示,气单胞菌和嗜水气单胞菌在GCAT基因的扩增区都能得到有效扩增,其中嗜水气单胞菌能同时在16SrRNA基因扩增区得到有效扩增...

根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10~(-2) ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。

【目的】十字花科作物根肿病是一种世界性病害,早期准确定量检测病原是实现有效防控的基础,研究旨在建立一种应用于水体中检测根肿菌的实时荧光定量PCR方法。【方法】采用近年已研究并发表的一对引物。建立并优化RT-PCR反应体系,利用大肠杆菌TG-1、大肠杆菌T1-1、大肠杆菌DH5α、肺炎克雷伯菌E3、枯草芽孢杆菌XF-1、解淀粉芽孢杆菌Y2、柑橘黄龙病病原菌、假单胞菌E12、成团泛菌L9、阴沟肠杆菌C6、荧光假单胞菌df等11种病原物进行RT-PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测不同接种浓度的水体中的根肿菌。【结果】得出标准曲线的回归方程为Y=-3. 452X+35. 118,其回归系数R2=0. 996,扩增曲线在1×101～1×107拷贝/μl范围内,具有较好的线性关系,扩增效率94. 833%,相邻扩增曲线间距均匀,1×101拷贝/μl为最低检测值。熔解曲线显示,所有产物具有单一峰形,有高度扩增特异性。重复性试验变异系数小于1%。在人工接种的水体中,检测下限至少为102个孢子/m L。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法具有快速、特异、敏感和稳定等优点,为检测根肿菌在水体中的含量提供了技术方法。

为准确、快速、便捷检测出土壤中根肿病菌休眠孢子量,应用所建立的根肿病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测技术,测定了湖南湘潭县响水乡、长沙县路口镇、桃江县桃花江镇十字花科作物根肿病发生地的42份土样的休眠孢子数量。检测结果表明,40份土样的根肿病菌休眠孢子量为(2.76×104~4.37×106)个/g;休眠孢子量≥104个/g的土壤均有根肿病发生,而休眠孢子量为8.42×102、9.78×102个/g的2份土样未发生根肿病,说明当土壤中根肿病菌休眠孢子量≥104个/g时,根肿病害易发生。