【目的】建立一种适用于瘤胃主要纤维降解细菌的RT-PCR定量检测方法,通过培养技术监测瘤胃纤维降解细菌在不同环境下的数量变化,为深入研究反刍动物瘤胃发酵机理以及对纤维素资源的有效利用提供技术支持。【方法】分别以Fibrobacter succinogenes、Ruminococcus flavefaciens与Ruminococcus albus的16SrDNA为靶序列设计相应的引物,建立SYBRGreenⅠRT-PCR定量体系。【结果】本研究所采用的引物及相应的PCR反应体系具有较高的特异性和灵敏度,检测极限可达50拷贝。采用RT-PCR方法检测瘤胃纤维降解细菌的定量结果与传统计数结果具有一...

【目的】应用Real-time PCR(RT-PCR)对蒙古绵羊瘤胃内容物固、液相附着微生物的生态分布进行定量研究。【方法】采集3只蒙古绵羊瘤胃内容物,固液分离后对各相中所附着的微生物进行定量检测,包括总细菌、总厌氧真菌和3种主要纤维降解菌-白色瘤胃球菌Ruminococcus albus、黄色瘤胃球菌Ruminococcus flavefaciens、产琥珀酸拟杆菌Fibrobacter succinogenes。【结果】固相中总细菌、总厌氧真菌和3种纤维降解菌的16S或18S rRNA基因考贝数显著高于液相,分别是液相附着微生物的7.22倍(P<0.05)、56.85倍(P<0.01)、2...

为获得高产纤维降解酶瘤胃厌氧真菌,从放牧饲养条件下随机选出10头屠宰后的青海大通牦牛瘤胃中采集食糜样本,通过亨盖特滚管技术筛选得到29株厌氧真菌菌株。以小麦秸秆为底物,测定这些菌株第6天培养液中乙酰酯酶、阿魏酸酯酶、木聚糖酶、羧甲基纤维素酶和微晶纤维素酶的活性。29株真菌之间5种酶活性差异显著,阿魏酸酯酶活性最高的菌株比活性最低的菌株活性高出7.9倍,差异最显著;而羧甲基纤维素仅高出2.5倍,差异最不显著。对各菌株5种酶活性进行相关分析,乙酰酯酶、阿魏酸酯酶、木聚糖酶和羧甲基纤维素酶相互之间均存在显著的正相关性(r>0.67,P

采用3×3拉丁方试验设计,3头安装永久性大口径瘤胃瘘管的青年黄母牛饲喂3种不同精饲料的日粮,3种精饲料分别为豆粕+玉米(日粮1),猪血粉+玉米(日粮2)和豆粕+小麦(日粮3)。精料日喂量按活牛体重的1%喂给,干玉米秸等量组成的日粮配给。试验为3个试验周期,每一周期为37 d,其中适应期30 d,在早晨采食后2、4、8、16和24 h,分别5次实施瘤胃掏空,全量测定瘤胃内容物存留量。试验结果表明,日粮1在采食后2~8 h瘤胃干物质、液体和NDF的存留量最低,与其他2种日粮相比差异显著(P<0.05);日粮1和日粮3瘤胃液氨氮数量和细菌氮的数量在采食后2~8h始终高于日粮2(P<0.05);日粮1...

选 5头装有瘤胃瘘管的丹麦红杂交牛 ,利用尼龙袋法按 5× 5拉丁方设计分别对经不同处理的 5种甘蔗渣即质量分数为 5 % Na OH碱化处理、质量分数为 7% Na OH碱化处理、氨化处理、复合处理蔗渣和甘蔗渣原样进行中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维 (ADF)、酸性洗涤木质素 (ADL)、纤维素 (CEL)和半纤维素 (HC)等纤维类物质瘤胃降解率的测定及降解参数的分析 ,以综合评定不同处理蔗渣的饲用价值 .结果表明 ,5 %、7%碱化处理 ,氨化处理 ,复合处理使蔗渣 NDF的纤维综合评价指标 (FDI)分别提高 3 6.1 5 %、5 1 .2 1 %、5 .83 %、5 4.62...

【目的】探讨瘤胃降解蛋白(rumen degradable protein,RDP)水平和非纤维性碳水化合物(non-fibrecarbohydrates,NFC)类型对人工瘤胃发酵、微生物合成和纤维分解菌菌群的影响。【方法】采用2×4双因素试验设计,即2种RDP水平和4种NFC类型(玉米淀粉、蔗糖、柑橘果胶和菊粉)。RDP水平通过向4种日粮中分别添加0(低RDP)或1.56 g(高RDP)酪蛋白酸钠调节。【结果】①主效应上,蔗糖和果胶组的干物质和有机物质表观消失率显著高于其它两组(P<0.01);日粮RDP水平和NFC来源在影响中性洗涤纤维的表观消失率上存在交互作用(P<0.01),低RDP...

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对...

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测的标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增,并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明:该方法检测灵敏度可达30拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有重复性好、特异...

研究根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列设计了两条引物,通过RT-PCR技术对IBDV的VP2进行扩增,构建IBDV-VP2的标准品质粒,建立基于IBDV-VP2基因的荧光定量RT-PCR检测(QRT-PCR)技术和标准曲线,并检测该QRT-PCR体系的特异性、灵敏度和重复性,最后将该QRT-PCR体系应用于鸡外周血淋巴细胞(PBLs)中IBDV超强毒株(vvIBDV)复制规律以及临床样品的检测。结果表明,建立的QRT-PCR体系特异性好,不能与NDV、IBV及FAV1等发生反应,敏感度为1.51×101拷贝数/μl,扩增效率达1.018,重复性试验组内变异系数和组间变异系数均小于...

采用体外产气量法 ,以球磨与未球磨玉米秸细胞壁为底物 ,对瘤胃微生物不同区系降解植物细胞壁的相对贡献和发酵特征进行了研究。用化学试剂和抗生素来分离瘤胃细菌、原虫和真菌 ,并设计下列微生物区系 :全瘤胃液 (WRF)、细菌 (B)、原虫 (P)、真菌 (F)、细菌 +原虫 (B +P)、细菌 +真菌 (B +F)、原虫 +真菌 (P +F)和负对照(CON)。结果表明 ,细胞壁经球磨后可以显著提高瘤胃微生物的产气量和降解率 (P

选择4头安装有瘤胃瘘管的泌乳奶牛,按4×4拉丁方设计,研究日粮精粗质量比约为30∶70的“高低质粗料型”日粮、30∶70的混合型高青贮日粮、50∶50的精粗料比例相当的日粮及65∶35的高精料日粮等4种不同精粗比日粮对瘤胃纤维降解酶活性及血液指标的影响。结果显示,奶牛采食4种精粗比不同的日粮,均能达到满足纤维降解及纤维分解菌生长要求的瘤胃pH值;日粮精粗比对微晶纤维素、羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶等瘤胃纤维降解酶活性的影响差异不显著(P>0.05),对奶牛颈静脉血中血浆葡萄糖浓度和血清生长激素、胰岛素、胰高血糖素浓度亦无显著(P>0.05)影响。说明4种精粗比日粮对奶牛瘤胃纤维降解酶活...

采用体外产气量法,研究了在高水平玉米秸(70%)底物日粮中添加烟酸(0、3和9μg/mL)对瘤胃发酵和纤维降解的影响。结果显示:日粮添加烟酸显著提高了72 h产气量、48 h总挥发酸的浓度、发酵液的羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的活性以及72 h干物质、中性洗涤纤维的降解率(P0.05)。随烟酸添加水平的增加,原虫的数量(P=0.082)、潜在产气量(P=0.056)、微晶纤维素酶活(P=0.078)和酸性洗涤纤维的降解率(P=0.093)均呈上升...

【目的】研究含不同水平硫酸钠日粮对陕北白绒山羊瘤胃纤维素降解率的影响,为选择适宜的硫添加水平提供理论依据。【方法】选择4只健康、体质量(28~32 kg)相近且安装永久性瘤胃瘘管的陕北白绒山羊为试验动物,采用4×4拉丁方单因素试验设计,试验分4个时期进行,每个时期14 d,分别饲喂硫酸钠添加水平为0(对照组),2.0,4.8,6.4 g/kg的4种日粮,测定瘤胃内青贮饲料干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)的动态降解率,计算青贮饲料瘤胃DM、NDF、ADF的有效降解率(PED),并进行显著性检验。【结果】与对照组相比,日粮中添加硫酸钠对瘤胃食糜外流速率(Kp)无显著影...

【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）野毒株、猪A群轮状病毒（GARV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪阿尔法冠状病毒（SADS-CoV）及猪捷申病毒（PTV）5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析，以PEDV野毒株为模板，对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针，并在两端保守区域设计上下游引物；在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针，并加入简并碱基。同时，分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针，用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化；用RStudio参照代码绘制ROC曲线，确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC，并计算Youden指数，最终确定检测临界值；从阳性核酸中扩增靶基因，并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录，获得5种标准品分别命名为：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估；并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为：35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×102 copies/μL，标准曲线线性关系良好，扩增效率在96.3%—104%之间；该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、大肠杆菌（E.coli）、猪链球菌（S.suis）和葡萄球菌（S.aureus）等多种菌毒株均不检出，具有良好的特异性；经重复性检验，组内变异系数在0.22%—3.08%之间，组间变异系数在0.89%—4.0%之间；对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较，符合率分别为：PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外，对临床样本检测结果显示，当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出；但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行，其总体阳性率分别达到：10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242)，且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染，使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究，为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR，为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。

利用RT-PCR法检测在盐、ABA、冷胁迫下TaGSK1基因的表达,结果表明,该基因在这几种胁迫下的表达均有提高,说明TaGSK1基因在对抗盐、ABA和冷逆境胁迫信号通路中具有重要作用。