【目的】研究奶牛瘤胃内参与蛋白质降解过程中二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidasesⅣ,DPP-Ⅳ)的序列特征和酶学性质。【方法】从奶牛瘤胃微生物Fosmid文库中挑选17 664个克隆,利用dpp-Ⅳ简并引物筛选含dpp-Ⅳ的阳性克隆。提取阳性克隆的质粒,用限制性内切酶HindⅢ进行酶切。PCR扩增含dpp-Ⅳ目的片段,并克隆测序。对阳性克隆的Fosmid末端进行测序。提取阳性克隆粗酶液,利用底物Gly-Pro-pNA检测肽酶活性。【结果】筛选后获得10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆(命名为DP1—DP10)。Fosmid末端序列经BLASTX比对后发现78%的序列可以与数据库的已...

利用脲酶选择性培养基,从奶牛瘤胃微生物BAC文库的15 360个克隆中筛选得到了12个脲酶克隆。利用酚-次氯酸法对脲酶克隆子的酶学性质分析,表明均具有不同的尿素分解能力,酶的活力范围是30~2 466 U/mg。脲酶阳性克隆插入片段大约是60 kb,限制性内切酶HindⅢ酶切图谱表明,各个克隆具有不同DNA片段,其中脲酶Urease 1、Urease 3、Urease 4和Urease 9的最适pH8.0,最适温度为60℃。本研究从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选到了具有脲酶酶活特性的克隆。

【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因的克隆子,并对其全长测序和生物信息学分析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法,从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因,鸟枪法测定基因序列后,进行基因注释、比对和系统发育分析。【结果】筛选得到了含ACCase基因的克隆(U12),其插入片段序列(URE12)全长43 358 bp,GC含量为43.75%,经GeneMark程序预测含有38个基因,经Signature程序预测属于变形菌门。ACCase基因(Acc-32)编码159个氨基酸,与Elusimicrobium minutum的ACCase基因具有41%的相...

【目的】利用Fosmid文库功能筛选法,获得山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因并进行原核表达。【方法】利用功能底物筛选法从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选具有蛋白酶活性的克隆子,对其进行Illumina二代测序,对预测到的基因进行功能注释,根据基因丰度结果确定后续研究的功能基因。利用大肠杆菌BL21(DE3)对功能基因进行诱导表达,对表达产物进行酶活性测定。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,将密码子优化后的功能基因分别敲入枯草芽孢杆菌C6基因组ctc位点并进行表达验证。【结果】从Fosmid文库1 700个克隆子中筛选到1个具有蛋白酶活性的阳性克隆Pro4-C5。通过二代测序技术,鉴定出3个潜在的蛋白酶基因gene0833(内肽酶,EC编号:EC3.4.21.53)、gene0196(金属内肽酶,EC编号:EC3.4.24)和gene0585(羧肽酶,EC编号:EC3.4.17.14)以及1个L-天冬酰胺酶基因(gene0683,EC编号:EC3.5.1.1)。以p ET-28a(+)为表达载体,通过大肠杆菌BL21(DE3)原核诱导表达发现,gene0585和gene0196未表达;gene0833表达的蛋白分子质量为87 ku,蛋白酶活性为10.45 U/mL;gene0683表达的蛋白分子质量为37 ku,L-天冬酰胺酶活性为88.52 U/mL,同时发现该蛋白也具有蛋白酶活性,酶活性为5.25 U/mL。将密码子优化后的gene0683和gene0833定点敲入枯草芽孢杆菌C6基因组中表达发现,gene0833未表达,gene0683表达的蛋白酶活性为109.72 U/mL,相比原始菌株(100.97 U/mL)显著提高了8.67%(P<0.01);L-天冬酰胺酶活性为31.63 U/mL,相比原始菌株(22.79 U/mL)显著提高了30.06%(P<0.01)。【结论】从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选和鉴定出了2个具有蛋白酶活性的功能基因(gene0833和gene0683),均来源于微小杆菌属(Exiguobacterium),其中gene0683在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达产物具有较高的蛋白酶和L-天冬酰胺酶酶活性。

利用宏基因组学方法,以人肠道微生物样品为原材料,构建了1个约30 000个克隆的fosmid文库。以三丁酸甘油酯为底物,通过功能筛选,获得1个酯解酶阳性克隆。对该阳性克隆构建亚克隆,挑选具有酯解酶活性的阳性亚克隆进行测序分析,最终获得1个肠道微生物来源的酯解酶基因(GenBank登录号:JQ972699)。结果表明,文库克隆的平均插入片段约为40kb,没有重复插入片段克隆。获得的酯解酶基因推演蛋白与Pyramidobacterpiscolens W5455的patatin样磷脂酶同源性最高,氨基酸一致性为95%。生物信息学分析结果表明该基因可能通过Vd型分泌方式进行分泌并发挥功能。本研究是通过...

分析不同品种牛的瘤胃微生物群落结构的差异,构建了1个鲁西肉牛瘤胃细菌16S rDNA文库,并从公共数据库中搜集来自荷斯坦奶牛、晋南牛、牦牛、黄牛和Hanwoo的9个16S rDNA文库,对序列多样性和文库组成等进行比较分析。结果发现:鲁西肉牛瘤胃细菌16S rDNA文库共有122个克隆,可分为109个操作分类单元。文库中91%的克隆来自未培养细菌,拟杆菌(Bacteroidales)和梭菌(Clostridiales)是其中的优势菌群。文库的定性和定量比较表明饲喂不同日粮的5个荷斯坦奶牛16S rDNA文库组成类似,而与鲁西肉牛等亚洲品种的文库存在显著差异。结果表明,牛的品种是瘤胃细菌群落差异...

利用脲酶保守序列ureC引物和细菌16S rDNA通用引物PCR扩增并测序,揭示奶牛瘤胃尿素分解菌的多样性。提取本研究室前期鉴定的16个脲酶克隆的质粒,利用脲酶保守序列ureC引物和细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,将PCR产物连接到pMD19-T载体,转化E.coliJM109,挑取阳性克隆测序。利用Blast程序将序列与GenBank和RDP数据库进行比对,并使用Mega 4.0软件构建系统发育树。4个脲酶克隆含有脲酶保守序列ureC,系统发育树分析表明,U1、U5、U13和U15分别属于Firmicutes、ε-Proteobacteria、β-Proteobacteria和A...

牛的瘤胃中富含各种微生物,微生物与瘤胃之间互生互利,对于牛的生长发育具有重要作用。本研究对牛瘤胃中常见的微生物菌群及其变化特征进行了综述,对影响牛瘤胃中微生物菌群变化的因素进行分析,以期为牛的生长发育、疾病防控和质量安全提供科学有效的指导。

选取3头5岁左右的健康雌性德昌水牛作为试验动物,采用机械破壁法提取瘤胃内容物总DNA,用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R扩增16S rRNA基因,构建16S rRNA基因克隆文库,分析德昌水牛瘤胃产甲烷菌区系组成。结果表明:试验共获得99个16S rRNA基因序列,RDP分析表明94.2%的序列为甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)16S rRNA序列,按照97%的相似性划分为19个分类操作单元,其中96个序列(17个OTUs)占总序列的97.0%,与已知细菌的16S rRNA序列的相似性≥97%;3个序列(2个OTUs)占总序列的3.0%,与已知细菌16S r...

探讨小花棘豆黄酮对绵羊瘤胃微生物数量的影响,为小花棘豆的综合利用提供参考。将12只和田羊随机分为4组,即对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组。试验组分别按10,30,50 mg/kg的剂量饲喂小花棘豆黄酮,试验持续35 d。试验前及试验后每隔7 d取瘤胃液,检测瘤胃液中微生物数量的变化。结果显示,与对照相比,试验羊瘤胃液中总细菌数均有不同程度的升高,其中从第21天开始试验Ⅰ组和试验Ⅱ组瘤胃液总细菌数均显著高于对照(P0.05);所有试验羊瘤胃液中厌氧真菌数和瘤胃原虫数均无明显变化,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组瘤胃液纤维素降解菌数量无明显变化,试验Ⅲ组可降低白...

瘤胃微生物区系变化与反刍动物的生长发育密切相关,微生物受宿主、环境、营养、管理等因素的影响,瘤胃微生物在反刍动物的生长发育、生产性能以及健康方面起着重要作用。本文综述了4种瘤胃微生物区系的建立过程与机制,以及微生物区系变化对动物代谢的影响,并阐述了瘤胃的调控技术与机理,为瘤胃调控技术应用、生产性能及健康水平提升、环境减排提供参考。

饲料中的脂肪除了供能以外,其生理功能主要体现在多不饱和脂肪酸的营养方面。笔者就反刍动物饲料中脂肪组成,瘤胃内脂肪水解、不饱和脂肪酸在瘤胃内的微生物氢化和脂肪合成等方面的研究进展做一综述。

采用５头装有瘤胃瘘管、十二指肠瘘管的土著种成年空怀母山羊，按自身对照设计，试验期山羊皮下注射孕酮１．２５ｍｇ／ｄ，以研究孕酮对瘤胃微生物氮代谢的调节及其作用机理。结果表明，皮下注射孕酮可进入瘤胃，并影响微生物的代谢活动，使十二指肠食糜微生物氮（ＭＣＰ－Ｎ），尿素氮（ＵＮ），氨氮（ＮＨ３－Ｎ）量极显著增加（Ｐ＜０．０１），但食糜总氮，过瘤胃蛋白氮（ＢＰＮ）或非氨氮（ＮＡＮ）无显著变化（Ｐ＞０．０５）。用放射免疫受体测定法对瘤胃细菌进行测定，发现山羊瘤胃细菌孕酮受体（ＢＰＲ）与孕酮的最大结合容量和Ｋｄ值分别为１０５．０１±１５．３２ｍｏｌ／ｍｇ（蛋白）和９．５４±０．４４×１０－８ｍｏｌ／Ｌ（ｎ＝...

[目的]本试验旨在研究壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂对湖羊瘤胃微生物菌群组成和代谢产物的影响。[方法]选取48只60～70日龄的健康湖羊[(15±5)kg],随机分为2组,每组24只,6重复,每重复4只羊。其中对照组饲喂全混合配方颗粒料,试验组于对照日粮中添加壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂(500 mg·kg~(-1)),预饲期7 d,正式试验80 d后进行屠宰,采集试验个体瘤胃液进行微生物和代谢组学相关数据分析。[结果]日粮中添加复合剂能够显著提高湖羊瘤胃微生物菌群的Chao1、Ace和Shannon指数,改变瘤胃菌群结构(P<0.05)。在门水平上,与对照组相比,复合剂显著提高瘤胃厚壁菌门(Firmicutes)和纤维杆菌门(Fibrobacteres)的相对丰度(P<0.05)。瘤胃内容物代谢组学结果表明,与对照组湖羊相比,复合剂组湖羊瘤胃中丙酸、磷酸葡萄糖酸、白藜芦醇和丁香酸等含量显著升高,而与脂质代谢有关的亚油酸、花生四烯酸、胆固醇、胆汁酸、棕榈酸、2-单硬脂酸酯、1-单十七烷基甘油酯等含量显著降低[错误发现率(FDR)

选取36头遗传背景相似的13～15月龄体质量为(332.8±49.9) kg的夏南牛，随机分成4组，每组3个重复，分别饲喂磷质量分数为0.15%、0.18%、0.20%、0.23%的日粮，预试期15 d，试验期60 d，测定夏南牛生长性能和血清生化指标，分析日粮磷水平对瘤胃微生物区系的影响。结果表明：日粮磷水平0.15%组夏南牛日干物质采食量极显著低于其他各组的；0.18%和0.20%组牛平均日增重显著高于0.15%组的；磷水平为0.20%时，夏南牛的平均日增重最高，达0.92 kg。不同磷水平日粮对夏南牛的干物质表观消化率、中性洗涤纤维表观消化率、酸性洗涤纤维表观消化率、粗蛋白表观消化率和钙表观消化率无显著影响，磷的表观消化率随日粮中磷水平的提高呈线性增加。日粮磷水平对夏南牛血清中钙、磷、尿素氮浓度和碱性磷酸酶活性无显著影响。日粮磷水平对夏南牛瘤胃发酵参数无显著影响，拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门。体质量为(332.8±49.9) kg的13～15月龄夏南牛推荐日粮磷水平为0.20%。