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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
赵倩明 左晓昕 詹康 隋雁南 封飞飞 赵国琦
为研究小肽转运蛋白对小肽转运和吸收机制提供细胞模型,在体外建立原代奶牛小肠上皮细胞分离的方法,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化液对奶牛小肠组织进行消化,通过2%山梨醇进行密度梯度离心以去除单核细胞、淋巴细胞和肌细胞;用刮除法、相差消化法和96孔板单克隆方法来纯化奶牛小肠上皮细胞,从细胞形态学、细胞角蛋白18免疫荧光染色和小肠上皮细胞特异性标志蛋白来鉴定奶牛肠上皮细胞。结果表明:1)采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶联合消化奶牛小肠组织,通过2%山梨醇密度梯度离心可以获得大量的细胞团且48h发生贴壁,但是细胞贴壁
[期刊] 淡水渔业
[作者]
宋增福 吴天星 潘晓东
探讨了健康鲫(Carassius auratus)幼鱼肠道上皮细胞的原代培养方法。结果显示,用含有抗生素、胶原蛋白酶Ⅰ、EDTA和胶原蛋白酶Ⅳ组成的D-Hanks液消化无菌分离的鲫肠道可以获得大量细胞团及绒毛隐窝;用含有抗生素、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素的DMEM培养液进行培养,并根据肠道上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间的差异进一步纯化,连续培养12d后可以得到纯化的肠道上皮细胞。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李小芬 詹康 张响英 陶勇 杨晓志 顾文婕
为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
姚仕彬 叶元土 蔡春芳 姚林杰 许凡 刘猛 萧培珍 王丽宏
以强化培育后草鱼的肠道粘膜为试验材料,采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团,分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果,并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程,同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果。结果表明:采用机械刮取消化法,分离转速为400 r/min,在使用M199培养液、6%CO2、15%胎牛血清、接种浓度为2×103(个/孔)条件下可批量复制草鱼原代肠道粘膜上皮细胞;细胞增殖过程符合动物原代肠道粘膜上皮细胞生长分化规律,采用荧光倒置显微镜与Giemsa染色法相结合、MTT检测法、AKP酶活力及LDH/M...
关键词：
草鱼 肠道粘膜细胞 分离方法 原代培养
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
向华 张彦明 程媛媛 康恺 杨幼聪
【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
姜茂成 詹康 严康 赵倩明 赵国琦
在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周传丽 刘铮铸 俞英 张勤
【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王菊花 张粟子 刘丹丹 王佳明 刘琦 董静 周杰 薛秀恒
【目的】比较不同消化酶对鸡胚小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)的分离和培养效果及细胞的热应激能力,为后续研究提供依据。【方法】以15日龄鸡胚为研究对象,分别使用0.5 g/L胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合及中性蛋白酶Ⅱ消化分离其小肠上皮细胞。培养不同时间后,观察IECs的生长状态,测定细胞生长活性;通过免疫荧光染色和免疫组化对所得IECs进行鉴定,确定最佳的消化酶。对优化所得鸡胚IECs于42℃分别进行2,3,4 h热应激处理,以37℃处理的IECs为对照,MTT法和流式细胞测定IECs的相对活力和凋亡率。【结果】细胞形态学观察发现,用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离得到了大量小肠绒毛隐窝团块,易贴壁,细胞生长快;用0.5 g/L胰蛋白酶和中性蛋白酶Ⅱ消化分离得到的细胞数量少,贴壁慢。用3种酶消化方法分离的细胞生长曲线均呈"S"形,但用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离的细胞生长曲线峰值较高,细胞活性强;联合消化所得IECs特异性标记抗原均为阳性,免疫荧光阳性率达(92.7±7.9)%,细胞膜质呈棕黄色,而对照组细胞膜质无着色。42℃下热应激3 h后细胞活力极显著下降,凋亡率为(35.96±1.57)%,极显著高于对照组的(0.67±0.02)%,可进行后续试验。【结论】采用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化可得到IECs;42℃下处理3 h是构建IECs热应激模型的条件。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
沈赞明 陈杰 陈伟华
采用3 H -TdR掺入法 ,分 3个系列分别研究了不同剂量五肽胃泌素 ( pentagastrin)对体外原代培养的牛瘤胃上皮细胞DNA合成的影响 ,五肽胃泌素受体拮抗剂丙谷胺对五肽胃泌素营养作用的影响 ,以及五肽胃泌素对新生奶公牛瘤胃上皮细胞DNA合成的影响。结果如下 :1)用终浓度 10 -11,10 -10 和 10 -9mol·L-1的五肽胃泌素分别处理成年奶牛瘤胃上皮细胞 ,使3 H -TdR掺入量增加 30 4 2 % ,2 4 2 6 %和 4 7 16 % (P
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
曲玥阳 陈旭 岳喜庆 罗勇 赵伟杰 林炳承
为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min和3h的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h时组织消化情况。利用MTT比色法考察了鼠尾I型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT比
关键词：
肾小管上皮细胞 原代培养 长期培养
[期刊] 华北农学报
[作者]
裴沛 熊慧 崔鹏 关伟军 马月辉
为建立鸡小肠上皮干细胞(Intestinal epithelial stem cells,IECs)体外培养体系并对其进行生物学特性研究,取18日龄鸡胚,分离小肠获得IECs,在DMEM/F12培养基中培养并观察其形态。通过传代及生长曲线的绘制分析其增殖情况,并经形态学观察及细胞免疫组织化学、RT-PCR等方法对所得到的纯化后的鸡小肠上皮干细胞进行鉴定。结果表明,鸡IECs可在体外扩增培养,目前传代至P11,纯化所得的鸡小肠上皮细胞经形态学观察及免疫荧光、RTPCR法鉴定为阳性,由此可得出结论:鸡小肠组织中可以分离出IECs,且能够在体外增殖培养。
关键词：
鸡 小肠上皮干细胞 分离培养 鉴定
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙秀梅 程帆 刘维 孙涛 薛秀恒 李培英 王菊花
【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
林红英 沈子龙 王伟强 张弈华 陈虹
用剪切及剪切加胰蛋白酶法消化兔泪腺组织,获取兔泪腺上皮细胞,设计相应的培养基,进行组织块原代培养或混合消化原代培养,用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果表明,组织块在体外培养10 d,可见上皮样细胞从植块边缘长出,2周后泪腺上皮细胞在培养瓶底部铺成单层,经传代3次,角蛋白染色阳性细胞纯度达90%以上;用混合消化法接种的细胞生长相对较慢。结果提示:用剪切组织块进行培养的方法简便易行,易获得符合要求的兔泪腺上皮细胞。
关键词：
兔 泪腺 上皮细胞 原代培养 鉴定
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
冯子建 孙娜 郝志立 孙盼盼 张华 范阔海 尹伟 杨惠珍 钟佳 张振彪 王建中 孙耀贵 李宏全
为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案，本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞，接种于两种不同的培养基后传代培养，探讨不同培养基下细胞的生物学特征，提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁，离心处理后得到乳腺上皮细胞，分别用完全培养基和基础培养基接种培养，经形态学对比观察，间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况，绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线；探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明：1)乳汁分离可得到大量细胞团块，分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞，消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达；2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主，传至第4代仅有少量细胞存活，细胞随着培养时间增加而状态变差，死亡细胞增多；接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长，随着传代次数增加细胞状态稳定，细胞生长曲线呈现“S”形；3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上，乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞，且与基础培养基相比，完全培养基可以更好地维持细胞活性，促进细胞增殖分裂，且不影响细胞冻存后复苏的活力，为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁月云 张莉莉 陈莎莎 王恬
为建立成熟的奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系,以组织块种植法培养荷斯坦泌乳期成年母牛乳腺组织,观测长出的上皮细胞在各生长时期的形态变化,绘制生长曲线并计算群体倍增时间,用免疫组化技术鉴定乳腺上皮细胞角蛋白18的表达,用SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析技术检测乳腺细胞的酪蛋白分泌情况。试验结果表明,此培养体系可获得良好的奶牛乳腺上皮细胞,原代以及传代培养,细胞增殖旺盛,长势良好;细胞骨架蛋白——角蛋白18表达为阳性,且培养的细胞具有分泌牛乳酪蛋白的功能。
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