[目的] 通过分析212株奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌分离株的耐药特性和超广谱 β-内酰胺酶(ESBLs)产生情况，以了解该类致病菌对新型抗生素的耐药现状，防范其对公共卫生安全产生的潜在威胁，为防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎提供参考。[方法]通过对分离株的细菌形态学观察、khe基因PCR检测和16S rRNA序列测定筛选并鉴定了肺炎克雷伯菌株，利用K-B琼脂平板扩散法和微量肉汤稀释法评估了肺炎克雷伯分离株的耐药性。[结果]结果显示：肺炎克雷伯菌耐药率由高到低依次为头孢吡肟占5.7% 、环丙沙星占4.7% 、头孢他啶占4.2% 、美罗培南占2.8%、厄他培南占0.5% 、亚胺培南和替加环素占0%。在替加环素中敏的菌株中均检测到ramR基因，但未发现tetX和ramA基因编码。在喹诺酮类抗生素耐受的菌株中，有2株检测到qnrA基因，6株检测到qnrB基因，23株检测到qnrS基因，未发现qnrD基因编码。在β内酰胺类抗生素耐受的菌株中，SHV-1、SHV-11、SHV-34、SHV-76、SHV-171、TEM-1、CTX-M-3、CTX-M-14、CTX-M-15、CTX-M-27、CTX-M-55、CTX-M-244、ACT-6、ACT-31、DHA-1、CMY-174、CMY-81和LEN-5检出率分别是6.56%、9.84%、1.64%、3.28%、1.64%、27.87%、8.2%、1.64%、3.28%、1.64%、9.84%、4.92%、3.28%、1.64%、9.84%、1.64%、1.64%和1.64%，未检测到上述耐药基因的突变体。[结论]本试验分离的肺炎克雷伯菌对新型头孢类抗生素产生耐药性，部分菌株具有多重耐药性，甚至对碳青霉烯类抗生素产生耐药。该结果提示我们需防范新型抗生素耐药菌株的产生和传播，以免引起公共卫生安全危害的发生，对防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎提出了新要求。

【目的】了解引起奶牛乳房炎的最主要病原菌葡萄球菌的耐药性,为奶牛乳房炎的防治提供参考依据。【方法】于2006~2007年在泰安地区5个规模化奶牛场,采集128份临床乳房炎奶牛乳样,用传统的细菌分离、培养和生化鉴定方法,对其中的葡萄球菌进行了分离,用K-B纸片扩散法对葡萄球菌的耐药性进行了检测调查。【结果】本次调查中共分离到29株葡萄球菌,其中金黄色葡萄球菌14株(14/29,47.4%),产色葡萄球菌3株(3/29,10.3%),木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌各2株(2/29,6.9%),头葡萄球菌和模仿葡萄球菌各1株(1/29,3.3%);葡萄球菌对头孢拉...

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种臭名昭著的机会致病菌，尤以高毒力肺炎克雷伯菌（Hypervirulent K. pneumoniae, hvKp）为重。幸运的是，多数hvKp对抗生素敏感。然而，近年来，多药耐药hvKp(multidrug-resistant hvKp, MDR-hvKp)引发病症的报告剧增，威胁着全世界人民的健康和安全。本研究报告了一例感染了不携带rmpA和rmpA2的MDR-hvKp的92岁慢性阻塞性肺疾病患者的病例。患者在住院后第8天去世。对患者痰液中分离得到的肺炎克雷伯菌21072329进行表型实验和全基因组测序，结果显示，21072329属于ST11-KL47 MDR-hvkp，该菌株对大蜡螟具有较高的致死率。同时，21072329有着较强的粘性，难以将其完全离心。21072329携带ESBL(extended spectrum beta-lactamase)基因（bla_(CTX-M-65), bla_(SHV-158),和bla_(TEM-1)）和碳青霉烯酶基因(bla_(KPC-2))，其对碳青霉烯类抗生素和第三代、第四代头孢菌素耐受。21072329虽具有hvKp的特征，但在其基因组中未发现rmpA和rmpA2。此外，它只携带了一种铁载体耶尔森菌素(yersinabactin)。这表明可能存在其他促进hvKp形成的高毒力因子。MDR-hvKp已经给全球医疗保健带来了巨大负担，携带未知高毒力因子的肺炎克雷伯菌则带来了新的威胁，因此迫切需要进行预防和深入研究。

从6尾患肠道胀气的病鳗腹水和肝脏病灶中分离、筛选出一株致病菌EP4,通过细菌形态学、生理生化测定及ATB Expression半自动细菌鉴定仪鉴定均符合肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)特性。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到EP4的部分16S rRNA基因序列,长约1 502 bp。将所测序列与GenBank中序列进行BLAST比对并构建系统进化树,结果表明其与肺炎克雷伯氏菌[DQ444287]的同源性最高(98.9%)。人工感染证明该菌株具有较强的致病力(致死率达70%),30种药物筛选结果显示,EP4对菌必治(头孢三嗪)、先锋V、头孢克洛、氧氟...

【目的】对1株疑似肺炎克雷伯氏菌进行分离鉴定及全基因测序分析,并对发现的新基因kp05372编码产物进行生物信息学分析。【方法】采用传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法,分别对采自麝粪便的1株病原菌的生理生化特征及16SrRNA序列进行测定;以小鼠感染试验和半数致死量(LD50)测试该病原菌的致病性;用全基因组测序方法对病原菌基因组进行测序分析,并对发现的新基因编码产物进行生物信息学分析。【结果】经生理生化试验和16SrRNA序列分析发现,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌,命名为GPKP,其对小鼠致死的LD50为6

为了有效地防控奶牛乳房炎,并掌握其发病原因,试验利用一般线性模型,分析了品种、年龄、胎次、泌乳月和采样季节诸因素对奶牛乳房炎的影响。结果发现:乳用牛比乳肉兼用型牛更容易患乳房炎;随着年龄的增长,奶牛乳房炎的发病率上升;在潮湿多雨的季节里,奶牛更容易得乳房炎;随着泌乳月的加大、胎次的升高乳房炎发病率有上升的趋势。

【目的】研究奶牛干扰素调节因子5（Interferonregulatoryfactor5，IRF5）基因在奶牛乳腺组织及乳腺上皮细胞炎症中的表达模式。【方法】利用RT-PCR和测序技术克隆得到IRF5基因的编码区（Codingsequence，CDS）序列，并采用生物信息学方法分析IRF5基因及其特性；利用qPCR技术检测IRF5基因及相关干扰素调节因子3（Interferonregulatoryfactor3，IRF3）和MyD88基因的表达量。【结果】IRF5基因的CDS长度为1500 bp，编码499个氨基酸，存在47个潜在磷酸化位点，氨基酸组成中脯氨酸（Pro）和亮氨酸（Leu）所占的比例较高。IRF5蛋白分子式为C_(2524)H_(3901)N_(671)O_(728)S_(20)，主要存在于细胞核和线粒体，理论等电点为5.38，是碱性亲水且不稳定的非分泌蛋白。蛋白互作分析结果显示，IRF5蛋白可能与骨髓分化初级反应蛋白（MyD88）、白细胞介素-1受体相关激酶1（IRAK1）、C-C基序趋化因子4（CCL4）、组蛋白乙酰转移酶p300（EP300）和核受体共激活因子3异构体X1（NCOA3）等蛋白相互作用，与机体或细胞的炎症反应有关。qPCR结果表明，与健康奶牛相比，IRF5基因在乳房炎奶牛的乳腺组织中的表达量极显著上调（P < 0.01）。在乳腺上皮细胞中，与对照组（0 h）相比，IRF5及其相关的Myd88和IRF3基因在LPS诱导乳腺上皮细胞炎症反应的3、6和12 h的表达量均极显著上调（P < 0.01）。【结论】IRF5基因在奶牛乳房炎过程中表达量上调，可能通过上述基因参与促进奶牛乳房炎症反应。

为探究噬菌体作为新型生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎和乳制品及其加工过程污染，以及对生物被膜清除的能力，以ATCC 700603为宿主菌从某牛场水样中分离得到1株肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，并通过透射电镜观察噬菌体形态特征；通过双层平板法测定噬菌体宿主谱；通过最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性测定噬菌体生物学特性；通过全基因组测序分析基因组的结构特征、比较其进化关系；通过结晶紫染色法和平板计数法测定噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果；通过牛奶试验分析该噬菌体对牛奶中肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明：1）从牛场水样中分离获得肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，能形成清晰透亮噬菌斑，透射电镜观察vB＿KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构。2）测定噬菌体宿主谱，表明vB＿KpnM-YP11能够裂解18/34株牛源肺炎克雷伯菌。3）生物学特性结果表明vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1,vB＿KpnM-YP11感染宿主菌潜伏期为30 min，爆发期为50～90 min,110 min后进入平台期，平均裂解量为69PFU/cell，在pH(3～11)和温度（4～60℃）范围内活性稳定。4)vB＿KpnM-YP11基因组全长166 607 bp,GC含量为39.52%，注释结果显示共有276个ORF和15个tRNA，不含耐药基因及毒力基因。5)vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1时，具有显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成能力。vB＿KpnM-YP11效价为10～8 PFU/mL,10～9 PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。在室温条件下，12 h内vB＿KpnM-YP11使牛奶中细菌浓度下降98%。综上，本研究分离获得噬菌体vB＿KpnM-YP11潜伏期短、裂解效率高，不仅能抑制和清除生物被膜，同时对牛奶中肺炎克雷伯菌也有显著的抑菌效果，具有作为肺炎克雷伯菌生物抗菌剂的应用潜力。

为了解浙江省奶牛乳房炎致病菌的耐药情况,评估其耐药表型与基因型的相关性,本研究从浙江省主要奶牛养殖区奶牛乳房炎病例分离到70株金黄色葡萄球菌,测定它们对13种常用抗菌药物的药敏性,并采用聚合酶链式反应(PCR)检测这些细菌耐青霉素G、庆大霉素、红霉素和四环素的耐药基因mecA、aac(6')/aph(2″)、erm和tetM的携带情况.结果表明,奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对常用抗生素的耐药情况严重,耐药表型和耐药基因型的符合率较高.70株金黄色葡萄球菌主要对青霉素G、庆大霉素、红霉素和四环素耐药,表型耐药率分别为90.0%、67.1%、50.0%和60.0%,耐药基因mecA、aac(6')/a...

【目的】旨在研究干扰素ε（Interferon epsilon，IFNE）基因在奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，bMECs）炎症中的表达模式及其潜在的分子功能。【方法】通过PCR和测序技术得到IFNE基因的编码区（Coding sequence，CDS）序列，并采用生物信息学方法分析IFNE基因及其蛋白质的特性；利用RNAi和qPCR技术检测IFNE、干扰素β（Interferon beta，IFNB）、干扰素κ（Interferon κ，IFNK）、半胱天冬酶3（Cystathione aspartase 3，CASP3）、半胱天冬酶9（Cystathione aspartase 9，CASP9）等基因在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导bMECs炎症反应中的表达量。【结果】IFNE基因的CDS长度为582 bp，可编码由193个氨基酸组成的具有亲水性且不稳定的非分泌蛋白。与对照组（0 h）相比，在LPS诱导3、6、12和24 h的bMECs中白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表达量均显著上调（P<0.05），白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）的表达量极显著上调（P<0.01），表明成功构建了炎症细胞模型。在炎症细胞模型构建成功的基础上，采用qPCR检测bMECs内IFNE基因的表达量结果表明，与对照组（0 h）相比，IFNE基因在LPS诱导bMECs第3、6、12和24 h的表达量均极显著上调（P<0.01），且在诱导6 h的表达量最高。RNAi实验结果表明，干扰IFNE可使得炎症性bMECs内的IL-8、IFNB、IFNK和白细胞介素-10受体亚基β（interleukin-10 receptor subunit β，IL-10RB）基因的表达量均显著上调（P<0.05），IL-6、IL-1β、CASP3、CASP9和BAD基因的表达量均呈极显著上调（P < 0.01）。【结论】IFNE基因在LPS诱导的bMECs炎症反应中的表达量极显著上调（P<0.01），干扰IFNE基因可通过调控IL-6、IL-8、IL-1β、IFNB、IFNK、CASP3和CASP9等基因的表达而缓解bMECs炎症反应，为奶牛乳房炎的分子治疗和抗乳房炎分子育种奠定了理论基础。

［目的］本文旨在探究ｐ３８通路及相关因子与乳房炎的关系。［方法］选择正常和患临床乳房炎２组共６头荷斯坦奶牛进行研究。收集２组奶牛的乳样、血样以及组织样品，利用石蜡包埋和ＨＥ切片染色对奶牛乳腺组织进行观察，通过实时荧光定量ｐＣＲ（ＲＴ－ｑ ｐＣＲ）对ｐ３８、ＴＬＲ４、ＴＮＦ－α和ＩＬ－１βｍＲＮＡ水平的表达进行分析，通过ＥＬＩＳＡ和ＷＥＳＴＥＲＮ ｂＬｏＴ对ｐ３８、ＴＬＲ４、ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β蛋白水平的差异表达进行分析。［结果］患乳房炎奶牛乳腺组织中ｐ３８、ＩＬ－１β和ＴＮＦ－αｍＲＮＡ水平表达显著升高（ｐ＜０．０５）。ＥＬＩＳＡ结果表明：两组样品中炎症因子ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β的表达水平差．．．

奶牛乳房炎发病率较高、病因复杂,是影响世界奶牛业发展的主要常见疾病之一。由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等病原体引起的临床和隐形乳房炎对动物性食品安全及畜牧业的正常发展构成巨大安全隐患,全球每年因奶牛乳房炎导致的经济损失多达数十亿美元。近年来随着测序技术的不断突破和测序成本的不断降低,生命科学的研究进入了多组学时代,其在畜牧业中的应用也越来越广泛。对奶牛乳房炎来说,传统的组织病理学筛查、体细胞计数、牛乳pH检测、牛乳电导率检测、酶活检验、红外热显影等诊断技术由于其自身的局限性难以充分全面地阐明其发病机理,已不能满足科研人员的需求。组学技术即Omics,主要包括基因组学技术、蛋白质组学技术和代谢组学技术等。通过基因组学研究不仅能从转录层面上揭示奶牛乳房炎复杂性状的表型变异及遗传基础,还能从转录后调控(miRNAs、LncRNAs等)和表观遗传学修饰(DNA甲基化、组蛋白修饰等)层面挖掘出相关的DNA和RNA变化及多分子间的相互作用规律,能够帮助我们更好地了解奶牛乳腺组织对病原体的免疫应答机制,筛选鉴定出乳房炎抗性的信号通路及关键候选基因,从而提高基因组预测或选择的准确性。利用蛋白质组学技术能够对不同环境不同状态的牛乳及乳腺组织的蛋白质种类、表达丰度、蛋白互作、翻译后修饰等进行比较分析,对差异表达的蛋白质经过COG功能注释、数据库比对、GO和Pathway富集分析,可以从蛋白水平揭示乳房炎发生及防御过程中的复杂调控机制,同时还能发现乳房炎诊断的标记分子,进而为乳房炎治疗药物的研发提供潜在的精准靶点。代谢组学是系统生物学的重要组成部分。通过代谢组学研究,能够同时对机体在内、外环境等复杂因素作用下及特定生理时期内所有低分子量代谢产物(如氨基酸、脂类、碳水化合物等)进行精准、高效的定性和定量分析,从而阐明相关的代谢途径;其作为基因表达的最下游,能使基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物水平上得到放大,进而可以更充分地反映细胞功能。将代谢组学技术应用到奶牛乳房炎研究中,能够分析出差异代谢物、鉴定出相关的生物标志物,进而揭示奶牛乳腺的生理及病理变化过程。总之,将各组学技术及多组学整合关联分析应用到奶牛乳房炎研究中可以更深入地揭示其病原防御机制,进而为乳房炎的预测、诊断和治疗提供有价值的参考和借鉴。本文就最近几年组学技术在奶牛乳房炎领域的研究进展进行综述,以期为我国奶牛健康及奶业安全发展提供指导。

为筛选出联合抗生素对肺炎克雷伯氏菌具有协同抗菌作用的天然产物。采用药敏纸片法测定肺炎克雷伯氏菌对8种抗生素的耐药性，采用微量肉汤稀释法测定抗生素和3种天然产物的最小抑菌浓度，应用棋盘法分别测定花青素和咖啡酸与抗生素联用对肺炎克雷伯氏菌的抗菌活性，并通过生长曲线评估咖啡酸与抗生素联用的协同抑菌作用。结果表明，肺炎克雷伯氏菌对8种抗生素均耐药，抗生素的MIC值为16->512 μg/mL。花青素和咖啡酸具有较好的抗菌活性，MIC值分别为25 μg/mL和1875 μg/mL，肉桂醛无抗菌作用，MIC>250 μg/mL。花青素与头孢他啶和克林霉素联用对肺炎克雷伯氏菌具有协同抗菌作用，2种抗生素的MIC值降低了4倍，咖啡酸与8种抗生素存在协同作用，抗生素的MIC值降低了8～>4096倍。抗生素与咖啡酸联用的协同抗菌效果优于其与花青素的组合，且咖啡酸与磺胺甲恶唑和氯霉素联合使用能持续抑菌至少24 h。本研究首次报道了咖啡酸与抗生素联用对多重耐药肺炎克雷伯氏菌具有显著协同抗菌作用，表明联合疗法是消减细菌耐药性的一种有效策略。

【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。

选患临床型乳房炎的奶牛20头,无菌采集奶样,分别接种于伊红-美兰培养基、普通营养琼脂、却浦曼琼脂、叠氮钠血琼脂、马铃薯培养基、牛奶琼脂培养基上,进行青霉素、链霉素、红霉素、氧氟沙星、环丙沙星、卡那霉素药物的混合菌药物敏感筛选试验,培养24~72h,根据抑菌圈的直径,判别为不敏感、中度敏感、高度敏感,分析出每个奶样的优选敏感药物;再用每一头奶牛奶样的优选敏感药物进行临床治疗试验,结果该20头奶牛中有19头的临床性乳房炎痊愈,这表明该混合菌药物敏感试验与临床治疗效果的吻合性达95%。