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[期刊] 水产学报
[作者]
李幸 温施慧 毛明光 姜志强 蒋洁兰
为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和Ig M基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点。根据Gen Bank中RAG1和Ig M的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和Ig M的基因片段。将所获基因片段分别插入到克隆载体p MD18-T中,从而构建太平洋鳕RAG1和Ig M基因的质粒标准品。建立并优化太平洋鳕RAG1和Ig M基因绝对荧光定量PCR方法。为进一步验证该方法的可靠性,分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异。以优化后的绝对荧光定量PCR方法检测不同发育时期太平洋鳕RAG1和Ig M的表达情况...
[期刊] 水产学报
[作者]
李幸 温施慧 毛明光 姜志强 蒋洁兰
为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制，通过ＲＡＧ１和ＩＧ Ｍ基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点。根据Ｇｅｎ ＢＡｎｋ中ＲＡＧ１和ＩＧ Ｍ的序列信息，分别设计１对特异引物，从太平洋鳕头肾中扩增得到ＲＡＧ１和ＩＧ Ｍ的基因片段。将所获基因片段分别插入到克隆载体ｐ ＭＤ１８－Ｔ中，从而构建太平洋鳕ＲＡＧ１和ＩＧ Ｍ基因的质粒标准品。建立并优化太平洋鳕ＲＡＧ１和ＩＧ Ｍ基因绝对荧光定量ｐＣＲ方法。为进一步验证该方法的可靠性，分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异。以优化后的绝对荧光定量ｐＣＲ方法检测不同发育时期太平洋鳕ＲＡＧ１和ＩＧ Ｍ的表达情况．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
曾东 肖拉 倪学勤
根据Gen Bank上的基因序列,在保守区设定并合成特异性引物,选择β–actin作为内参基因,采用SYBR Green I染料法,进行熔解曲线分析和标准曲线的制作。熔解曲线表明,β–actin、IL–1β、IL–8的基因产物均为特异性产物,其Tm值分别为86、82.5和84℃;标准曲线表明,各基因Ct值的检测范围为12~32,扩增效率分别为96.3%,103.2%和102.6%,具有良好的线性关系,且r2均大于0.990;组内变异系数分别为0.14%~0.86%,0.18%~0.93%和0.13%~0.86%;用建立的方法检测健康建鲤头、肾组织中IL–1β、IL–8的表达情况,相对表达量分别...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李碧侠 赵芳 任守文 王学敏 方晓敏
SIRT1基因对细胞的生存、衰老、凋亡等生理活动起着十分重要的调节作用。为了建立荧光定量PCR技术检测猪SIRT1基因表达量,根据GenBank中猪SIRT1 mRNA序列设计引物,建立基于SYBR Green I染料技术的荧光定量PCR检测方法。结果表明,所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感和特异性强等特点,为猪SIRT1基因定量分析提供了技术平台。
关键词：
猪 SIRT1 荧光定量PCR
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙航 姜志强 蒋洁兰 温施慧 李幸 暴宁 苏鹏 毛明光
本研究通过克隆首次得到太平洋鳕(Gadus macrocephalus)干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的部分序列。该序列长1878 bp,包含长1377 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码459个氨基酸,其编码的蛋白质分子量约为51 k D。经氨基酸序列比对发现,太平洋鳕IRF3的氨基酸序列包括1个含有5个保守色氨酸残基的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和1个保守的C端IRF关联域(IRF association domain,IAD);系统进化树分析表明,太平洋鳕I...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
韩建强 许文花 高斌
根据GenBank上猪GAPDH基因的序列设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了Real-time PCR方法。以阳性重组质粒为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点。研究结果为GAPDH作为内参基因用于猪相关基因定量表达分析奠定了基础。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
姜海军 陈琼 孔繁德 李国平 黄印尧 徐淑菲
参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
邓力 张彦明 李维维 杨幼聪 谭晓妮
【目的】建立一种能够实际应用于猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量检测的荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中登录号为AF091507的猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株的全长基因组序列,在其5′非编码区设计2对特异性引物(标准品引物、定量引物)和1条探针(qPCR-P),通过标准品引物进行RT-PCR扩增及T7 RNA聚合酶体外转录构建标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法,并采用该法对成品猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行检测。【结果】成功构建了体外转录的标准品RNA,建立了检测猪瘟兔化弱毒的荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达10拷...
[期刊] 水产学报
[作者]
曹泽艺 周庆杰 陈凯 习丙文 谢骏 潘良坤 毛颖
为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张小敏 周斌 何丹妮 庞然 赵津 陈溥言
根据GenBank中的猪源抗病毒蛋白Mx1基因(poMx1)序列设计1对特异性引物,从Mx1基因全长片段中扩增和克隆了特异性的115 bp核苷酸片段。测序鉴定正确后将重组质粒进行定量并10倍倍比稀释作为扩增模板,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,建立Mx1的标准曲线及回归方程。结果显示:该标准曲线的回归方程为Y=-2.986 3 lg X+38.239 3(R2=0.998 5),灵敏度为1×102μL-1;应用该方法对猪瘟兔化弱毒苗接种猪肾细胞(PK-15)后产生的poMx1 mRNA进行定量分析,发现病毒感染细胞4 h后,poMx1的表达量最高(P<0.01),然后随着时间...
关键词：
猪源Mx1 实时荧光定量PCR 标准曲线
[期刊] 华北农学报
[作者]
马鹏 李林杰 常秋燕 王悦萦 郭富城 刘萍 马晓霞 马忠仁
利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
吴绍强 李海艳 林祥梅 郑腾 李西峰 刘建 梅琳 韩雪清 贾广乐
选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。
关键词：
派琴虫 贝类 实时荧光PCR 检测
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
吴田 蓝增全 王华芳
为了解决诺丽实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测中无内参基因的现状,根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以诺丽果实总RNA反转录成c DNA为模板,进行PCR扩增,扩增出的基因片段克隆到p MD-18T载体,阳性克隆经PCR鉴定后测序。序列结果表明:该片段长393 bp,编码131个氨基酸;所得序列与麦蓝菜actin 1有最高的一致性(96%)和相似性(98%)。q RT-PCR结果表明,诺丽Actin基因在诺丽的各个组织、果实不同发育时期都能稳定表达,且表达水平基本一致,适合在
关键词：
基因克隆 内参基因 序列分析 表达分析
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵丽 赵绪永 陈红英 崔保安
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈利达 袁军海 李磊 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚
为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。
关键词：
镰孢菌 实时荧光定量PCR 湿度 病残体
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