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[期刊] 中国水产科学
[作者]
汪俊 薛长湖 李兆杰 蔡跃飘 何闪闪 杨文鸽
利用pH9.5的甘氨酸缓冲液性处理太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)匀浆液,PEG沉淀病毒粒子的方法对未知的是否污染有诺瓦克样病毒(Norwalk-like Virus,NLVs)的牡蛎样品进行处理,并提取病毒RNA,进行RT-PCR,凝胶电泳检测扩增结果。初步建立了牡蛎中NVLs的检测方法。纯化所得的特异PCR产物,克隆到T-载体中,筛选转化子,提取质粒,并进行PCR电泳鉴定。重组质粒序列测定结果在NCBI上进行BLASTn显示所得产物与已发表的诺瓦克样病毒的相应序列具有极高的同源性(>95％);根据Genebee在线分析系统AliBee-Multiple Alignment进...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
潘晓艺 刘杜鹃 沈锦玉 张宇飞 蔺凌云 王军毅 郝贵杰 姚嘉赟 徐洋 袁雪梅
罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)和双顺反子病毒(M.rosenbergii dicistrovirus,MrDV)是已报道对罗氏沼虾易感的主要致病性病毒,该研究通过建立双重RT-PCR方法对MrDV和MrNV两种病毒同时进行检测。根据MrDV和MrNV基因组序列的保守区分别设计特异性引物,并对双重PCR的退火温度和引物浓度进行优化,在获得优化反应体系和反应条件后,对罗氏沼虾样品进行检测。结果表明,双重PCR最佳退火温度为60℃,反应体系最佳引物终浓度MrNV384为0.1μmol/L,MrDV472为0.05μmol/L,对...
[期刊] 水产学报
[作者]
高文辉 白昌明 蔡生力 王崇明
为了建立适用于Ｏｓ ＨＶ－１不同变异株的检测方法，在牡蛎疱疹病毒（Ｏｓ ＨＶ－１）３个变异株全基因组序列比对的基础上，筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的ＤＮＡ聚合酶（ＤＮＡ ｐＯｌｙｍｅｒＡｓｅ）基因，据此设计巢式ｐＣｒ引物，优化ｐＣｒ反应体系和条件，建立了基于Ｏｓ ＨＶ－１ ＤＮＡ聚合酶基因的巢氏ｐＣｒ检测方法（ｐ－Ｎ ｐＣｒ检测方法），利用ｐ－Ｎ ｐＣｒ与ＣＮ ｐＣｒ检测方法对不同年份和宿主来源的Ｏｓ ＨＶ－１疑似感染样本进行检测。结果显示，ｐＮ ｐＣｒ检测方法能稳定地检出１００拷贝／μｌ的病毒ＤＮＡ；ｐ－Ｎ ｐＣｒ较Ｃ－Ｎ ｐＣｒ检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明，本研究．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
梁学超 向本春 程朝玲 苏海娣 郑银英
本文通过一步法RT-PCR技术,检测新疆加工番茄马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)感染率。结果表明,新疆加工番茄马铃薯Y病毒感染率为25%。选取10个样品利用RT-PCR技术,克隆CP基因,获得807 bp全长CP基因,编码268个氨基酸。CP基因序列比对分析与系统进化树分析表明,侵染新疆加工番茄的马铃薯Y病毒属于PVYN:O株系。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈信忠 苏亚玲 龚艳清 黄丽莎 俞秀霞 苏永全
神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯光惠 杜虎平 李夏隆 亢福仁
【目的】分析陕北8个县(区)马铃薯X病毒外壳蛋白(CP)基因序列的一致性和变异性,明确病毒变异程度,为脱毒马铃薯的推广提供参考。【方法】以陕北8个县(区)种植2~3代疑似携带病毒的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取8个采样点马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯X病毒CP基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后对CP基因进行克隆并测序,使用DNAstar软件分析陕北马铃薯X病毒CP基因序列的一致性,并与国内外其他地区12个马铃薯X病毒进行比较,采用邻接法构建系统进化树。【结果】从陕北8个县(区)马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的长度为...
[期刊] 华北农学报
[作者]
吴志明 贾晓梅 谢晓亮 温春秀 田伟 张庆良
根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,经RT PCR法扩增出全长的cDNA片段,结果从感病组织中扩增出与预期的360bp大小的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将其克隆到质粒pGEM T载体上,进行全序列分析。结果表明,与国内外的报道相比较,核苷酸同源率高达98%以上。PCR产物克隆作为RT PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,为进一步进行抗PSTVd基因工程研究打下了良好基础。
[期刊] 华中农业大学学报(自然科学版)
[作者]
袁志豪 李振锋 陆月霞 蔡丽
为明确百合在生产中被病毒侵染的情况,利用高通量测序技术对云南、浙江等地的百合染病样品进行病毒鉴定,通过序列比对和拼接,获得了车前草花叶病毒(plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)、百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)、大丽花花叶病毒(dahlia mosaic virus,DMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、玄参花叶病毒(figwort mosaic virus,FMV)、玫瑰黄脉病毒(rose yellow vein virus,RYVV)、大丽花普通花叶病毒(dahlia common mosaic virus,DCMV)、木薯脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus,CsVMV)等8种已知病毒和2种未知病毒的序列信息。对从云南、浙江、江西、上海、广东、湖南6个省(市)采集的48份百合样品进行了上述8种病毒的RT-PCR检测。结果显示,在百合样品中,DMV、RYVV、PlAMV和LMoV发生普遍,检出率均高于95%,FMV检出率高于85%,CMV检出率最低,且仅在云南省昆明市的样品中检出,而DCMV和CsVMV未检测到。检测样品中百合病毒复合侵染率为100%,单一样品检测出3～6种病毒,共有6种复合类型,以云南省昆明市的百合病毒复合侵染情况最复杂,昆明的单一样品均有5～6种病毒感染。以上结果表明,所检测地区百合病毒的检出率和复合侵染率都较高,因此,在生产中应实时监控和检测百合植株的带毒情况,及早发现染病植株,防止病毒扩散和传播,以免造成经济损失。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
战文斌 邢婧 王远红 铃木信一 福田颖穗
对虾WSSV病是亚洲对虾养殖业中的一个棘手问题。本研究采用Kimura引物 ,用PCR技术对不同生长期的中国对虾 (Penaeuschinensis)进行了WSSV的检测 ,同时也检测了对虾发病时养殖池中多见的野生厚蟹 (Helicesp .)和矛尾刺虎鱼 (Acanthogobiushasta)。检测结果表明 :分别在检测的 5尾亲虾中的 1尾 ,6尾仔虾中的 1尾 ,5尾稚虾中的 3尾及所检测的 5尾病虾和 2只厚蟹中获得到 982bp的PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阳性。在检测的 2尾矛尾刺虎鱼中均未获得PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阴性。在亲虾、虾苗以及虾池内的野生厚蟹...
关键词：
对虾 白斑症病毒 聚合酶链反应
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
贾添慧 董蕾 王永杰 喻勇新
为了解决目前巢式PCR法检测牡蛎样品中GⅡ型诺如病毒时存在的非特异性扩增、假阴性等问题，本研究对NCBI数据库中在线获得的所有GⅡ型诺如病毒序列进行系统分析，重新设计出针对GⅡ型诺如病毒检测的通用型巢式PCR引物（NG2OF/NG2OR），并从基因型覆盖度、特异性、灵敏度和实际样品检测的稳定性几个方面对新设计的引物进行评估。结果显示：（1）新引物的特异性好，只对GⅡ型诺如病毒进行有效扩增，且不受牡蛎样品本底的影响。（2）新引物灵敏度高，最低可检测至26.4个拷贝。（3）在对92个牡蛎样品进行检测时，新引物的阳性检出率为28.3%，比经典引物高出7.5%。因此，新建立的GⅡ型诺如病毒巢式PCR检测方法在检测牡蛎样品时特异性更强，灵敏度更高，为牡蛎中诺如病毒的检测提供了一种新的、可靠的技术手段。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
童桂香 黎小正 卢小花 廖永志 江林源 韦信贤
罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测Mr...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨杰 王军 周彤 陈志德 仲维功
为了明确江苏新发生的矮缩病害为水稻黑条矮缩病,采用RT-PCR和序列测定方法对其病原进行了精确鉴定。根据水稻黑条矮缩病病毒基因组序列的信息,设计扩增RNA聚合酶基因、外壳蛋白基因和RNA沉默抑制子基因以及核心蛋白基因部分编码区的4对引物,提取感染水稻黑条矮缩病病毒的水稻植株总RNA并进行RT-PCR扩增,可以在感病植株中分别扩增出水稻黑条矮缩病病毒基因组特有的4个条带,测序结果表明,来源于江苏南京的分离物的4个基因部分编码片段与已登录的对应基因片段核苷酸序列同源性达99%以上,共发现7个碱基的突变。经生物信息学分析发现7个单碱基突变都是同义突变,氨基酸序列没有改变。根据以上结果确认该病病原为水...
关键词：
水稻黑条矮缩病 RT-PCR 病毒检测
[期刊] 中国水产科学
[作者]
马冬梅 白俊杰 邓国成 李胜杰 叶星 江小燕
为了早期快速诊断近年来流行于广东省养殖大口黑鲈(Micropterussalmoides)中的病毒性溃疡综合征,本研究用基因组步移的方法获得了大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouthbassulcerativesyndromevirus,LBUSV)主要衣壳蛋白(MCP)基因,该基因编码区全长1392bp。通过序列比较分析,在MCP基因内确定了一段241bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物,经过优化PCR反应条件,建立了可以快速检测大口黑鲈溃疡综合征病毒的PCR方法。实验表明,在PCR进行到30个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是104拷贝数/μL,相当于104个病毒粒子。利...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈阳婷 桑有顺 冯焱 陈涛
为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒...
关键词：
马铃薯 RT-PCR 病毒检测
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
黎小正 韦信贤 吴祥庆 黄国秋 黄玉柳
Taura综合征病毒(TSV)是世界动物卫生组织(OIE)目录规定的水生动物二类疫病病原体。本研究在RT-PCR方法检测TSV行业标准的基础上,优化建立了能更准确检测TSV的套式RT-PCR。敏感性试验结果表明,所建立的套式RT-PCR的灵敏度大约为常规RT-PCR的103倍,最低可检测到10fg的TSVRNA。分别应用两种RT-PCR方法对180份来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有52份检出TSV,而常规RT-PCR仅有23份检出TSV。表明所建立的套式RT-PCR提高了TSV的阳性检出率,较常规RT-PCR有更大的应用价值和意义。
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