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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孔庆学 张涌
采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。
关键词：
未成年大鼠 睾丸支持细胞 分离纯化
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王帅 贾琦珍 张玲 王连群 陈根元
【目的】研究和田羊睾丸支持细胞的体外培养特性。【方法】取新生和田羊睾丸组织,利用两步酶消化后,采用差速贴壁法纯化细胞进行体外培养,并通过形态学观察、HE染色、AKP染色、油红O染色、吖啶橙染色、罗丹明123染色、免疫组化染色、RTPCR和MTT法检测细胞活性及纯度。【结果】培养基中加入2.00%血清浓度的DMEM/F-12可提高支持细胞纯度,在体外培养传至20代的和田羊睾丸支持细胞形态和核型均为正常;所培养的细胞内波形蛋白表达及标志基因SCF和GDNF的表达均为阳性。【结论】本试验成功建立了和田羊睾丸支持
关键词：
和田羊 睾丸 支持细胞 体外培养 鉴定
[期刊] 西南农业学报
[作者]
高艺 黄泳 冯贤辀 王维勇 徐永健 龚婷
【目的】研究建立一种高效制备从江香猪睾丸支持细胞（Sertoli cells，SCs）体外分离培养方法，为后续香猪雄性繁殖的科学研究提供细胞材料，为同类小型香猪支持细胞的分离培养提供参考。【方法】采用0.1% Ⅳ型胶原酶和0.25%胰酶-EDTA组合酶消化法消化睾丸组织，差速贴壁法纯化支持细胞，使用含10%胎牛血清完全培养基培养支持细胞，观察其形态特征并记录生长曲线，经苏木精-伊红（HE）染色、RT-PCR及免疫荧光染色进行支持细胞的鉴定。【结果】组合酶法消化后可获得大量生精上皮细胞混悬液，刚分离的支持细胞呈圆形或椭圆形，分离培养5～6 h后SCs贴壁，贴壁后细胞形态呈梭形或不规则形，培养3～4 d后细胞之间呈紧密连接，可清晰观察到细胞核及细胞质中的颗粒状物质或小空泡；SCs分离后1～2 d增殖速度缓慢，培养3～6 d细胞增殖速度加快，活性增强，进入对数生长期，培养7～8 d后细胞增殖速率下降，原代支持细胞生长曲线呈S形；HE染色显示SCs细胞核为深紫色，细胞质呈淡红色；RT-PCR结果显示支持细胞特异性基因WT1、SOX9均表达；免疫荧光染色结果显示特异性基因GATA-4抗体免疫阳性率达90%以上。【结论】成功建立从江香猪睾丸支持细胞的原代培养方法。
关键词：
睾丸支持细胞 分离培养 鉴定 从江香猪
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蔡沛蓉 冯楠楠 郑豪 邹辉 顾建红 刘学忠 袁燕 刘宗平 卞建春
[目的]本文旨在探讨玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对睾丸支持细胞(Sertoli cells,SC)乳酸产生的影响,[方法]以Wistar大鼠SC为研究材料,采用不同浓度的ZEA(0、0.1、1、10、20、30μmol·L~(-1))处理24 h,利用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测试剂盒检测ZEA对SC的毒性作用;乳酸测试盒检测ZEA对SC内、外乳酸产生的影响;丙酮酸测试盒检测ZEA对SC内丙酮酸产生的影响; Western blot检测SC乳酸代谢通路相关蛋白的表达;免疫荧光法检测乳酸产生关键酶LDH荧光强度的改变。[结果]随着ZEA浓度的增加,ZEA对SC的细胞毒性逐渐增大(P<0.01);与对照组相比,染毒组细胞内、外乳酸含量和细胞内的丙酮酸含量显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),葡萄跨膜糖转运蛋白1(GLUT1)和乳酸脱氢酶(LDH)在1、10、20、30μmol·L~(-1)ZEA染毒组的蛋白表达量极显著降低(P<0.01);单羧酸转运蛋白4(MCT4)在30μmol·L~(-1)ZEA染毒组的蛋白表达量呈显著降低(P<0.05);免疫荧光检测结果表明,LDH的荧光强度随着染毒浓度增加而降低,与对照组相比,10、20、30μmol·L~(-1)ZEA染毒组细胞内的蛋白表达量均极显著下降(P<0.01)。[结论]ZEA可以抑制SC乳酸产生,干扰SC对生殖细胞的能量供应,进而对雄性生殖功能产生损伤。
关键词：
玉米赤霉烯酮 睾丸支持细胞 乳酸 丙酮酸
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王菊花 刘丹丹 刘琦 王佳明 董静 周杰 薛秀恒
为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P>0.05),其它各组均显著低于对照组(P0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P
关键词：
山羊 支持细胞 分离和培养 氧化应激
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
韩雅婷 杨学义 徐小明 史明艳 窦忠英
采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。
关键词：
表皮干细胞 分离 培养 鉴定
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
薛振华 刘国世 史建民 王梁 田秀芝 王永彬 侯保民 田见晖 曾申明 朱士恩
对达兰仔猪睾丸精原细胞及精原干细胞进行了体外分离、纯化和初步鉴定。对8 d达兰仔猪的睾丸实质组织,采用Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶和胰酶组合消化法分离精细管细胞,制备单细胞悬液,用Percoll不连续密度(11%、19%、27%、35%和43%)梯度法纯化精原细胞;对纯化后的细胞培养12 h,细胞贴壁后进行碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定,初步确定精原干细胞及其比例。结果表明:所获精细管细胞悬液中活细胞和死细胞所占的比率分别为92.65%和7.35%,平均每克睾丸可获得4.17×107个细胞;精原细胞主要分布于19%~27%的Percoll梯度带中,经纯化后其纯度为47.62%,精原干细胞占该带细胞的比...
关键词：
达兰猪 精原干细胞 分离 纯化 精原细胞
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
穆杨 张彦明 童德文 王玉东 李崴 李玉清 郑增忍
将培养收获的M SB 1细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次后,调整细胞浓度为2×106/mL,然后每毫升细胞悬液加2 IU木瓜蛋白酶和1 mm o l/L的L-胱氨酸溶液0.1 mL,混匀后37℃作用1 h以分离M SB 1细胞表面M AT-SA。对木瓜蛋白酶处理前后的M SB 1细胞进行间接荧光抗体染色以检测M ATSA的分离情况。获得的M ATSA粗提物经超滤浓缩和Sephadex G-75凝胶纯化后,用SDS-PAGE检测纯化的结果。试验结果表明,从M SB 1细胞表面分离到M ATSA,经电泳获得了纯化的M ATSA,其相对分子质量约为35 ku。结果为M ATSA单克隆抗体的制备及其相关的研...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
冯楠楠 王冰洁 朱启航 郑王龙 邹辉 顾建红 袁燕 刘学忠 刘宗平 卞建春
[目的]探究磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路在玉米赤霉烯酮(ZEA)诱导睾丸支持细胞(SC)自噬及影响SC细胞周期分布中的作用,揭示ZEA对雄性生殖毒性的机制。[方法]以Wistar大鼠原代睾丸支持细胞为材料,利用Western blot、流式细胞术和免疫荧光技术等方法检测PI3K/Akt/m TOR信号通路在ZEA对SC自噬及细胞周期分布的影响。[结果]随着ZEA浓度升高,PI3K/Akt/m TOR信号通路关键蛋白磷酸化水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);加入PI3K抑制剂LY294002后,微管相关蛋白1轻链3(LC3)的荧光信号强度显著增强,荧光聚点更加明显(P<0.05或P<0.05或P<0.05),且细胞周期关键激酶Cdc2的活性显著增加(P
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁逍 刘琳 陈迪 马海田
为了建立体外模拟氧自由基诱导的细胞氧化损伤模型,本试验采用Percoll密度梯度离心法纯化原代大鼠Leydig细胞,并鉴定特异性蛋白3β-HSD;采用MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、ROS以及O·-2含量,比色法测定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT和POD的活性。结果显示:特异性蛋白3β-HSD鉴定后,荧光显微镜观察到大部分细胞呈现特异性荧光。MTT测定结果显示,300~1 000μmol·L-1H2O2处理细胞均可极显著降低细胞活力(P<0.01);300μmol·L-1H2O2处理可显著提高Leydig的凋亡率以及增加ROS含量(P<0.05)...
关键词：
H2O2 睾丸间质细胞 氧化损伤
[期刊] 西南农业学报
[作者]
蔡金霞 黄明光 胡传活 张鑫 梁莹莹 纪伟霞 冯妮 葛晨玲 陈志英 李珣 王晓晔
【目的】分析他克林对脂多糖(LPS)诱导小鼠睾丸支持细胞(TM4)炎性损伤的保护作用，从炎症角度探索他克林的功能，为动物生产过程中雄性动物生殖疾病相关抗炎药物的利用及精子质量提升提供更多药物选择。【方法】采用CCK8法检测0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL LPS分别诱导3.0、6.0、12.0和24.0 h对TM4的适宜损伤条件；同时分析0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00、10000.00和100000.00 μg/mL他克林在加入LPS前预处理0.5、1.0和2.0 h或加入LPS后处理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h对TM4炎性损伤的适宜保护条件。以荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测TNF-α和IL-6基因mRNA表达水平，以ELISA法进一步评价细胞上清TNF-α和IL-6蛋白表达量，以免疫蛋白印迹(WB)法分析NF-κB蛋白表达量。【结果】不同浓度不同处理时间下，LPS对TM4增殖的影响情况存在差异，其中1.00 μg/mL LPS处理12 h TM4的增殖率极显著低于空白组（P0.05）。【结论】0.01 μg/mL他克林后处理6.0 h对TM4的保护作用最佳，其机制可能与IL-6和TNF-α基因mRNA及蛋白表达量下调有关。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张高峰 郭彤 魏华 马珂
以Ⅳ型胶原酶消化法分离鲫(Carassius auratus)肝细胞,然后将其分成2组,一组不再经过进一步处理(即对照组);另一组再用Percoll液密度梯度离心纯化肝细胞(即实验组),然后将2组细胞接种于DMEM/F12培养基中培养10 d。在倒置显微镜下观察2组肝细胞的形态并绘制细胞生长曲线;采用台盼蓝染色法比较2组肝细胞的存活率;通过HE染色法在光镜下检测肝细胞的纯度;采用MTT比色法测定2组肝细胞的增殖率;收集肝细胞培养上清液检测白蛋白、尿素以及乳酸脱氢酶的水平以检测2组肝细胞功能。结果表明,对照组鲫肝细胞存活率为80.6%,纯度为83.2%;实验组肝细胞存活率和纯度明显高于对照组(P...
关键词：
鲫 肝细胞 分离 纯化 Percoll法
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王霞 邬静
以原代分离培养仔猪睾丸支持细胞为模型,经含不同浓度(0、2.5、5、10、20、40、80、160μmol/L)乙酸棉酚或40μmol/L乙酸棉酚加800μmol/L的乙酰半胱氨酸(NAC)的培养基培养24 h后,检测细胞增殖率、细胞内活性氧(ROS)水平和丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性、培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性及细胞凋亡情况,研究棉酚对仔猪睾丸支持细胞的氧化应激及细胞凋亡的影响。结果显示:棉酚呈浓度依赖性抑制仔猪睾丸支持细胞增殖率,棉酚浓度大于等于10μmol/L时,细胞增殖率极显著降低;棉酚造成细胞内ROS水平显著升高、SOD活性显著降低、MDA含量升高及培养基中LDH活性升高;NAC显著抑制棉酚诱导的细胞内ROS水平升高、细胞增殖抑制及细胞凋亡。表明棉酚能诱导仔猪睾丸支持细胞凋亡,这可能与过量ROS生成而造成细胞氧化应激有关。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
冯健豪 刘怀瑾 唐梓宁 王水莲 杨闯
分别用质量浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的铁皮石斛提取物处理小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞) 24 h，采用细胞增殖检测试剂盒(MTS)检测细胞活力；qRT–PCR检测增殖与凋亡相关基因、睾酮合成酶基因、睾酮合成酶相关转录因子及其上游调控因子的mRNA表达水平；Western blot检测凋亡相关基因、睾酮合成酶的蛋白表达水平；ELISA法检测TM3细胞睾酮分泌水平。结果表明：与不加铁皮石斛提取物的对照组比较，40 μg/mL铁皮石斛提取物处理TM3细胞，显著提高了其增殖活力；细胞增殖相关基因Ki–67和PCNA mRNA表达水平、抗凋亡基因Bcl–2 mRNA表达水平、Bcl–2蛋白表达水平、睾酮合成酶基因StAR、P450scc、3β–HSD、CYP17a1和17β–HSD mRNA表达水平、P450scc、CYP17a1和17β–HSD的蛋白表达水平、睾酮合成酶相关转录因子Nur77和SF–1 mRNA表达水平均极显著高于对照组的；BAX和Caspase–3蛋白表达水平、NF–κB mRNA和蛋白表达水平极显著低于对照组的；其上游调控因子CREB MT3细胞睾酮浓度显著高于对照组的。说明40 μg/mL铁皮石斛提取物可通过调控睾酮合成酶基因及其相关转录因子的表达促进睾酮的合成。
关键词：
铁皮石斛提取物 小鼠间质细胞 睾酮合成
[期刊] 华北农学报
[作者]
尹荣焕 白文林 方和春 王健民 潘树德 刘宝山 刘金玲 姜卓
按毒理学方法给小鼠灌喂不同剂量喹乙醇,采用原位末端标记法检测该药物饲料添加剂对生精细胞凋亡作用的影响。结果表明:各试验组小鼠生精细胞凋亡指数较正常组和阴性对照组均有所增加,在不同时间,高剂量组均表现差异显著(p<0.05)或极显著(p
关键词：
喹乙醇 生精细胞 凋亡
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