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[期刊] 水产学报
[作者]
刘海燕 杨汝晴 陈玉磊 张凌晶 孙乐常 刘光明 曹敏杰
为探究大黄鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）的性质。本研究采用生物信息学方法对大黄鱼MBSP进行基因检索与筛选，通过分子克隆得到大黄鱼MBSP编码区全长cDNA并构建毕赤酵母表达系统得到重组蛋白质（Lc-rMBSP），分析Lc-rMBSP的酶学性质和二级结构并通过同源建模分析Lc-MBSP的三级结构。结果显示，大黄鱼肌原纤维蛋白中存在MBSP，在55 ℃下活性最高。大黄鱼基因组中注释为类胰蛋白酶的基因有16条，对这些基因与淡水鱼MBSP进行系统进化树分析和多序列比对，得到同源性较高的基因序列（Lc-MBSP）。Lc-MBSP编码区全长735 bp，共编码244个氨基酸残基。通过毕赤酵母重组表达，分离纯化得到分子量约28 ku的重组蛋白质Lc-rMBSP。表达蛋白的最适温度和pH分别为50 ℃和8.0。圆二色谱分析表明，温度对Lc-rMBSP二级结构具有较大的影响。Lc-rMBSP在较宽的温度范围内（40～60 ℃）对MHC具有较高的水解活性。Lc-rMBSP的最适底物为Boc-Leu-Lys-Arg-MCA，并且特异性切割羧基侧的精氨酸残基，而不分解赖氨酸残基。通过同源建模得到Lc-MBSP的三维结构，催化三联体由保守的His-61、Asp-105和Ser-198构成，其底物结合口袋（Ser-192、Gly-215和Ser-225）与类胰蛋白酶的略有不同，这种差异可能是导致Lc-rMBSP与其他胰蛋白酶酶学性质不同的主要原因。本研究可为海水鱼MBSP的研究提供理论参考。
[期刊] 水产学报
[作者]
郭川 梁银龙 刘光明 苏文金 曹敏杰
肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是最近发现的一种蛋白酶。该酶参与肌原纤维蛋白的降解及鱼糜制品弹性的下降。但是,对该酶一级结构的研究,迄今为止,未有报道。本文根据已测定的鲤MBSP N-末端氨基酸序列以及丝氨酸蛋白酶活性中心保守序列设计兼并引物,结合RT-PCR技术实现了MBSP基因片段的扩增。再根据克隆到的MBSP片段序列设计基因特异引物,用于MBSP基因的5′和3′末端快速扩增。综合以上结果,鲤MBSP的全长被确定。序列分析表明,MBSP cDNA含有一732 bp的开放阅读框,编码243个氨基酸残基,其中信号肽长度为...
[期刊] 华北农学报
[作者]
连凯琪 纪爽 周玲玲 时志琪 王飞 张元臣
为了克隆黏虫丝氨酸蛋白酶的全基因序列，并进行原核表达，以黏虫为研究对象，利用RT-PCR扩增丝氨酸蛋白酶的部分基因，进而通过RACE技术，得到丝氨酸蛋白酶全基因，通过Blast等软件对获得基因序列和推导的蛋白质序列进行分析，并利用大肠杆菌表达系统对其进行表达。结果表明，成功克隆黏虫丝氨酸蛋白酶全基因，将其命名为MsPG,序列全长2 010 bp,开放阅读框为1 593 bp,编码530个氨基酸，蛋白质分子质量为67.6 ku,等电点为7.63,且具有含6个半胱氨酸的clip结构域，推测其为clip型丝氨酸蛋白酶。MsPG氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫序列一致性在70.00%～91.92%,其中与烟芽夜蛾(GenBank登录号：PCG78401.1)序列一致性最高，达到91.92%。成功构建重组质粒pET30a(+)-MsPG,其在大肠杆菌原核表达系统中0.1 mmol/L IPTG诱导下的最佳表达温度是25℃。综上，黏虫丝氨酸蛋白酶MsPG具有丝氨酸蛋白酶家族保守的功能位点，且能够在体外进行原核表达。
[期刊] 水产学报
[作者]
任中阳 崔雅清 陈玉峰 石林凡 郝更新 杨燊 邱绪建 翁武银
大黄鱼肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）乳化性的研究尚待深入探究，以满足大黄鱼蛋白质高值化开发利用的需求。本研究旨在探究不同pH对大黄鱼MP结构性质及其乳化性的影响。采用pH分别为2、4、6、8、10、12的低盐磷酸缓冲液处理大黄鱼MP，通过SDS-PAGE分析大黄鱼MP降解情况，利用接触角测量仪和荧光分光光度计考察其疏水性变化。将不同pH下大黄鱼MP溶液与大豆油以1:1（V/V）的比例经高速均质制备乳液，并对其乳滴电位、粒径以及乳液的乳析指数进行测定，综合分析在不同pH下乳液的稳定性。SDS-PAGE电泳结果表明，在pH 4时，大黄鱼MP条带颜色较浅，在pH 6～12时，肌球蛋白重链条带基本消失，肌动蛋白条带颜色逐渐加深，且在浓缩胶顶部出现了高分子聚集物。根据接触角和荧光光谱综合分析表明大黄鱼MP疏水性随pH增加而增加。对不同pH下MP乳液特性分析显示，在pH 8时，乳滴带负电且Zeta电位绝对值大[（49.63±1.52）mV]、粒径较小、乳液稳定性较好，而pH 12条件下容易出现破乳不利于乳液的稳定。在pH 8时，大黄鱼MP结构更有利于提升乳液稳定性。pH对大黄鱼MP结构性质和乳化性的影响探究，有望为大黄鱼MP在食品工业中的开发利用提供理论依据。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李洋 刘萍 李健 李吉涛 马朋 高保全
采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp,开放阅读框1 245 bp,编码414个氨基酸,其预测分子量为45.06 kD,理论等电点为5.694,并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,达到49%。组织表达分析表明,serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是肝胰腺和鳃组织,在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺组织中serpi...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡黎明 曾玲 申建梅 宾淑英 廖泓之 陈高峰 林进添
【目的】克隆桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因(Bactrocera dorsalis serine protease,BdorSer),研究BdorSer在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其可能参与的生理过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆BdorSer,对其编码蛋白氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法,研究BdorSer mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了BdorSer,该基因ORF全长1 239bp。氨基酸序列一致性分析表明,BdorSer与...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王倩 张雪 陈亚东 沙珍霞
甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1 (Mannan-binding lectin associated serine protease 1,MASP1)是补体凝集素途径中起重要作用的激活蛋白。本研究以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象,应用RACE技术和实时荧光定量qRT-PCR技术对半滑舌鳎MASP1基因(Cynoglossus semilaevis MASP1, CsMASP1)进行了克隆和表达模式分析。结果显示,CsMASP1基因c DNA序列全长为2507 bp,5′非编码区长82 bp,3′非编码区长142 bp,开放阅读框长2283 bp,共编码760个氨基酸;CsMASP1基因包含13个外显子和12个内含子,与多数已知鱼类的MASP1基因结构一致;SMART分析显示,CsMASP1包含6个结构域,与哺乳动物、鸟类、其他鱼类的结构域一致;同源比对发现,CsMASP1和鱼类的相似度较高,与金目鲈(Latescalcarifer)的相似性最高,为76%。CsMASP1基因在11种健康组织(血液、脑、鳃、性腺、心脏、头肾、肠、肝、皮肤、脾和后肾)中均有表达,其中,在肝、脾和头肾中表达量较高;鳗弧菌(Vibro anguillarum)感染后,CsMASP1基因在6种免疫组织(血液、鳃、头肾、肠、肝和脾)中呈现不同的表达模式,在6种免疫组织中呈现明显的上调表达,肝的表达峰值出现在感染后24 h;脾和鳃的表达峰值出现在感染后6 h;肠、头肾和血液的表达峰值均出现在感染后12h;随着病原菌感染时间增加,基因表达量逐渐降低并恢复至正常水平。研究表明,CsMASP1基因参与了半滑舌鳎的免疫应答过程,本结果为半滑舌鳎的免疫机理研究奠定了基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
苗亮 李明云 陈莹莹 胡谋 陈炯
为研究冷诱导结合蛋白(CIRP)在大黄鱼低温适应过程中的作用,采用同源克隆技术获得了大黄鱼CIRP基因,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了低温胁迫下大黄鱼各组织中CIRP基因的表达变化。结果显示,大黄鱼CIRP基因cDNA序列全长1211 bp,推测编码一个由182个氨基酸组成、分子量为19 ku的蛋白。序列比对显示硬骨鱼类CIRP基因序列较为保守,特别是N端的RNA识别基序(RRM)高度保守。系统进化树分析显示大黄鱼CIRP与银鳕相似性最高(81.5%),所有硬骨鱼类聚为一个大支。慢性
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵海龙 孟庆玲 乔军 陈双庆 王国超 谢堃 胡政香 才学鹏
根据GenBank中少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶P186基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR扩增获得目的基因片段,构建重组表达质粒pET32a-P186,转化到大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。结果表明,P186基因cDNA全长为1 224 bp,编码407个氨基酸,其中第1~21位为信号肽序列,氨基酸序列的第156~167位、192~202位、343~353位分别是天冬氨酸(Asp160)、组氨酸(His192)、丝氨酸(Ser345)活性位点所在区域,属于Subtilase家族,包括2个潜在的N-联糖基化位点(Asn249、Asn342)及与底物结合的S1区(SBP)S...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李游山 赵萍 董照明 邹勇 夏庆友 向仲怀
【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王小龙 叶坤 王志勇 韩芳
克隆大黄鱼脾酪氨酸激酶基因(Larimichthys crocea spleen tyrosine kinase,LcSyk)并分析其结构,通过荧光定量PCR技术分析该基因的组织表达谱以及受LPS、Poly I:C和灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)免疫刺激后的表达变化规律。结果显示:LcSyk基因cDNA全长2 761 bp,其中开放阅读框为1 851 bp,编码616个氨基酸,预测相对分子质量为70 527,理论等电点为8.13;LcSyk在所检测到的大黄鱼组织(心脏、肝
[期刊] 水产学报
[作者]
王丹丹 刘逸尘 张亦陈 孙妍 耿绪云 孙金生
Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应,进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程,在调节机体免疫及其它重要生理功能等方面发挥着重要作用。在前期研究中,从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-serpin,GenBank登录号:DQ318857),初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒(WSSV)引发的中国明对虾先天免疫应答反应;利用原核重组表达系统,成功获得了重组的中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂(rF...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
曾勇 王文超
设计简并引物,PCR扩增了克氏原螯虾(Procam barus clarkii)丝氨酸蛋白酶类似物基因的部分序列,通过与GenBank登录的序列进行比对,结果显示该序列编码的氨基酸与其他物种的丝氨酸蛋白酶类似物氨基酸序列有较高的同源性。SMART软件分析发现其催化三联体结构中的丝氨酸被甘氨酸取代,不具备蛋白酶水解活性。
[期刊] 水产学报
[作者]
尹丝雨 何雨欣 于娇 张亦陈 刘逸尘 耿绪云 孙金生
丝氨酸蛋白酶(SP)是一类分布广泛的蛋白水解酶，行使着一系列重要的生理功能，包括参与消化作用、血液凝结、胚胎发育和免疫应答过程等，但在甲壳动物中仅见初步报道。对虾的养殖持续面临着病害的困扰，深入开展对虾免疫防御机制研究，将会为寻找抗病新思路提供借鉴。本研究利用RACE技术克隆获得了一个新的凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologs, SPHs)基因(Lv-SPH)的全长cDNA序列，通过生物信息学方法分析了其序列特点，并利用实时荧光定量PCR (qPCR)方法探讨了其组织分布特征和应答病毒感染的表达变化模式。生物信息学分析显示该基因全长1 249 bp，开放阅读框(ORF)区长1 005 bp,5′-UTR为156 bp,3′-UTR为88 bp,ORF区编码334个氨基酸，氨基端的16个氨基酸为预测的信号肽序列。经在线分析软件SMART分析显示，Lv-SPH含有一个clip结构域和一个高度保守的SP结构域(Tryp-SPc)，后者具有3分子活性催化位点，前2个是组氨酸和天冬氨酸，第3位为甘氨酸。该基因在凡纳滨对虾各种组织中有不同程度的表达，其中在血细胞中表达量最高，在肝胰腺、心脏和肠道中广泛表达，而在肌肉中表达量最低。注射白斑综合征病毒(WSSV)后24 h,Lv-SPH的相对表达量显著升高，病毒感染后48 h达到最高，约为对照组的3倍。Lv-SPH具备典型的SPH家族成员特征，具有一定的组织表达特异性，WSSV可以显著诱导该基因表达上调，表明其可能参与了WSSV引发的凡纳滨对虾免疫应答过程。研究结果为深入探讨对虾天然免疫调控机制提供了参考，在对虾健康养殖及病害防治方面具有潜在的应用价值。
[期刊] 水产学报
[作者]
储卫华 陆承平
根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％,扩增片段编码343个氮基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。
关键词：
嗜水气单胞菌 丝氨酸蛋白酶基因 克隆
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