为探究大豆GmPP2C89基因在植物非生物胁迫响应和适应过程中的功能，利用转录组数据和荧光定量PCR方法检测GmPP2C89基因在NaCl、PEG和甘露醇处理下的表达模式；接着分析GmPP2C89基因启动子上响应非生物胁迫的顺式作用元件，并根据元件的分布克隆不同长度的启动子构建融合GUS载体，获得对应的转基因拟南芥，通过GUS染色分析启动子对NaCl、PEG和甘露醇处理的响应。构建GmPP2C89基因过表达的转基因拟南芥，在正常条件和NaCl处理条件下测定根长、叶片MDA含量和电解质渗透率以及盐胁迫相关基因(SOD、POD、CAT、RD26、RD29A和RD29B)的表达水平。结果显示，NaCl、PEG和甘露醇处理均导致大豆GmPP2C89基因表达水平显著上调；在其启动子区含有较多ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等参与非生物胁迫响应的顺式作用元件，并且该启动子对NaCl处理具有更强的响应。此外，在盐处理条件下，转基因拟南芥GmPP2C89-OX根长显著大于WT,而MDA含量和电解质渗透率显著低于WT,耐盐性明显增强；抗氧化酶基因(SOD和POD)和ABA途径关键基因RD29B在GmPP2C89-OX中的表达水平显著高于WT。结果表明，大豆GmPP2C89基因受NaCl、PEG和甘露醇诱导表达上调，GmPP2C89过表达可通过激活抗氧化途径和ABA途径增强转基因拟南芥的耐盐性。

[目的] 本研究旨在解析大豆DREB（Dehydration responsive element-binding protein）转录因子基因GmDREB8与干旱胁迫的关系，为DREB转录因子参与大豆干旱胁迫的分子机制研究奠定基础，也为大豆耐旱转基因育种提供新的基因资源。[方法] 针对大豆品种‘天隆一号’，通过荧光定量PCR（qRT-PCR）分析10个DREB基因在干旱胁迫诱导下的表达模式及GmDREB8在大豆不同组织和植物激素处理下的表达情况。采用生物信息学方法分析GmDREB8保守基序和亚细胞定位情况。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达体系进行GmDREB8蛋白的亚细胞定位。分别在拟南芥中异源表达GmDREB8和利用VIGS（virus-induced gene silencing）技术在大豆中沉默GmDREB8，分析该基因在拟南芥和大豆干旱胁迫中的功能。[结果] 10个DREB基因在干旱胁迫下都被诱导表达，但这10个基因间表达谱存在差异。筛选并克隆得到GmDREB8，其位于大豆17号染色体上，含有1个AP2结构域，蛋白相对分子质量为19.79×10~(3)，pI为9.76。GmDREB8基因受到植物激素赤霉素（ABA）和水杨酸（SA）的诱导表达。GmDREB8蛋白位于细胞核内。异源表达GmDREB8转基因拟南芥在不同浓度的甘露醇处理下表现出比野生型更短的根长，对干旱胁迫更敏感。与空载对照相比，大豆GmDREB8沉默株系的叶片在干旱处理后具有更低的相对电导率、相对失水率、丙二醛含量（MDA），更高的游离脯氨酸含量（Pro），表现出更强的耐旱性。[结论] GmDREB8可负向调控植物的耐旱能力。

【目的】对比大豆PremiRNAs候选内参基因和传统内参基因的表达稳定性，筛选出适合盐、碱胁迫条件下RTqPCR分析的最稳定内参基因。【方法】选用了6个保守的PremiRNAs基因和4个常规的内参基因作为候选内参基因，通过RTqPCR的方法，利用GeNorm和NormFinder软件，评价了10个候选内参基因在大豆盐、碱胁迫条件下的稳定性。【结果】大豆盐胁迫下，叶中表达最稳定的基因组合是PremiR166和PremiR172，表达最稳定的单一基因是FboX；根中表达最稳定的基因组合是Act11和EF1A，表达最稳定的单一基因是Act11。大豆碱胁迫下，叶中表达最稳定的基因组合是PremiR39...

【目的】对比大豆Ｐｒｅ－ｍｉｒＮＡｓ候选内参基因和传统内参基因的表达稳定性，筛选出适合盐、碱胁迫条件下ｒＴ－ｑＰＣｒ分析的最稳定内参基因。【方法】选用了６个保守的Ｐｒｅ－ｍｉｒＮＡｓ基因和４个常规的内参基因作为候选内参基因，通过ｒＴ－ｑＰＣｒ的方法，利用ＧｅＮｏｒｍ和ＮｏｒｍＦｉＮｄｅｒ软件，评价了１０个候选内参基因在大豆盐、碱胁迫条件下的稳定性。【结果】大豆盐胁迫下，叶中表达最稳定的基因组合是Ｐｒｅ－ｍｉｒ１６６和Ｐｒｅ－ｍｉｒ１７２，表达最稳定的单一基因是ＦｂｏＸ；根中表达最稳定的基因组合是ＡＣＴ１１和ｅＦ１Ａ，表达最稳定的单一基因是ＡＣＴ１１。大豆碱胁迫下，叶中表达最稳定的基因组合是Ｐｒ．．．

[目的]本文旨在研究大豆GmCLC-d1/d2基因及其启动子对盐胁迫的响应，并探索其参与植物盐胁迫适应过程的生理机制。[方法]从大豆品种‘Lee68’中克隆了GmCLC-d1/d2基因，分别构建其植株RNA干扰(RNAi)和过表达载体，通过发根农杆菌介导转化获得RNAi和过表达大豆发根组合植株，利用根癌农杆菌介导转化获得过表达拟南芥，分析和比较盐胁迫下植株的形态和生理指标变化。[结果]与转空载大豆发根组合植株相比，盐处理下RNAi-GmCLC-d1/d2植株鲜重、叶片相对含水量(RWC)和叶绿素含量，根和叶过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性明显下降，根、叶相对电解质渗漏率(REL)和丙二醛(MDA)含量以及根、茎、叶Cl~-含量明显上升，NO~-_3含量显著下降，导致根、茎和叶，特别是地上部Cl~-/NO~-_3值显著上升；而发根过表达大豆植株OE-GmCLC-d1/d2的上述指标表现相反，耐盐性有所增强。盐胁迫下过表达GmCLC-d1/d2拟南芥种子发芽率、幼苗根长以及3周龄植株鲜重、叶片RWC及叶绿素含量等均明显优于野生型，地上部REL和MDA含量显著降低，CAT、POD和SOD活性明显增强；根和地上部Cl~-含量明显降低，NO~-_3含量明显上升，导致根和地上部，特别是后者Cl~-/NO~-_3值显著下降。[结论]GmCLC-d1/d2可通过增强盐胁迫下NO~-_3在发根过表达大豆组合植株或过表达拟南芥化植株根部的吸收以及向地上部的转运和分配，并在一定程度上抑制Cl~-的吸收和转运，以维持植株特别是地上部较低的Cl~-/NO~-_3值，从而增强耐盐性，其中GmCLC-d2基因的效应更明显。

盐胁迫能够加速草坪草的黄化,影响草坪的坪观质量。植物中的NAC转录因子在盐胁迫条件下发挥着重要作用,参与胁迫响应,而在日本结缕草(Zoysia japonica)中还鲜有NAC转录因子的功能研究。本研究对转ZjNAC3基因(GenBank登录号:MT254544)的YPH500酵母菌株进行盐敏感性检测,初步判定ZjNAC3在盐胁迫下具有负调节酵母细胞生长的作用;对过表达ZjNAC3基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)株系进行盐处理,发现150 mmol·L-1 NaCl处理7 d后转基因植株的生长明显弱于野生型(wild type, WT),脯氨酸含量、丙二醛含量、细胞膜透性均显著高于WT(P <0.05),表明过表达ZjNAC3基因降低了拟南芥植株的耐盐性。分析认为ZjNAC3通过减弱渗透调节、增加细胞受损和降低将Na+隔离到液泡的作用,从而使得转基因拟南芥植株表现出盐敏感的性状。本研究揭示了ZjNAC3是一个负调控植物耐盐性的重要基因,为之后探究NAC转录因子调控日本结缕草的耐盐性及其机理奠定了基础。

【目的】进一步探讨GATA转录因子Ac-nsdD在茯砖茶的冠突曲霉中的调控作用。【方法】根据基因组注释结果及构建系统进化对冠突曲霉Ac-NsdD蛋白序列分析。运用同源重组和根癌农杆菌介导的方法构建Ac-nsdD基因敲除的突变体，对突变体进行表型分析。【结果】根据基因组注释结果分析冠突曲霉Ac-nsdD编码一个假定的具有保守DNA结合结构域ZnF GATA的转录因子。系统进化分析表明，Ac-nsdD与其它真菌同源的NsdD有较为紧密的亲缘关系。进一步运用同源重组的方法，获得一个该基因敲除的突变体。与野生型菌株比较，突变体在M3Y培养基培养，表现为产闭囊壳量明显减少；然而在5%NaCl M3Y培养基培养，突变体表现产闭囊壳量变少，产分生孢子量显著变多，中间培养物黑色色素形成显著增加，生长速度变小；在17%NaCl M3Y培养基培养，突变体表现闭囊壳数目几乎为零，分生孢子量变少，生长速度变小。【结论】Ac-nsdD基因在无盐环境下可能激活有性发育。该基因在应答低渗透压盐胁迫条件下，可能激活有性发育和抑制无性发育，平衡有性和无性发育，且参与色素的生物合成；在应答高渗透压盐胁迫条件下，可能激活有性发育、无性发育和营养生长。本试验为进一步研究与Ac-nsdD基因相偶联的一些信号通路及其下游基因，为丝状真菌的有性及无性发育的一些共有的和独特的信号转导途径提供实验室数据。

【目的】AtNEK6是在拟南芥中发现的一种NIMA相关激酶,在拟南芥中过表达AtNEK6能够促进植物的生长发育,提高植物的耐盐耐旱性。通过将AtNEK6转化棉花,研究其在抗逆中的分子机理,为培育耐旱耐盐碱棉花新品种提供理论基础和种质资源。【方法】采用农杆菌转化法,将来源于拟南芥的AtNEK6导入棉花,通过实时荧光定量PCR分析转基因株系中AtNEK6的表达量;通过观察转基因植株表型和扫描电镜观察细胞表皮细胞,分析转基因棉花的生长发育情况;利用甘露醇和NaCl模拟干旱处理和盐处理分析转基因棉花的耐盐耐旱能力,通过测定相关生理指标,鉴定AtNEK6对转基因棉花耐逆的贡献。【结果】利用卡那霉素筛选获得转基因幼苗,通过PCR鉴定获得10个不同的转基因株系;利用qRT-PCR分析筛选出表达量较高的L7、L17、L25株系。正常条件下,与野生型相比,转基因棉花的株高增高、叶面积增大,生长发育得到了促进,通过扫描电镜观察发现转基因棉花叶片的细胞表面积与野生型并无明显差异,细胞周期相关基因CYCB1;1和CYCA3;1及生长发育相关基因GhGRF5、GhEOD、GhAN3和GhEBP1的表达量均上调。通过耐盐耐旱性分析,正常条件下,与野生型相比,转基因株系的根长、鲜重和干重均无明显差异,仅侧根数增多;在250 mmol·L~(-1)甘露醇处理条件下,转基因株系的根长、侧根数、鲜重和干重均显著高于野生型,表现出更好的生长状态;在200 mmol·L~(-1)NaCl处理条件下,转基因株系的侧根数、鲜重和干重均显著高于野生型,相比于野生型生长状态更好。温室中正常生长1月龄的转基因棉花,在300 mmol·L~(-1)甘露醇处理条件下,转基因植株的SOD活性比野生型提高了0.65倍、0.42倍和1.45倍,CAT活性提高了0.65倍、0.64倍和0.42倍,MDA含量降低了0.51倍、0.41倍和0.22倍;250 mmol·L~(-1)NaCl处理结果与甘露醇类似,转基因棉花的耐盐生理指标均优于野生型。另外,相关胁迫响应基因GhAREB、GhDREB、GhNCED和GhLEA5在转基因棉花中的表达量均显著高于野生型棉花。【结论】AtNEK6通过参与细胞周期和生长发育的调控过程促进棉花的生长发育,同时提高棉花在逆境中的耐盐耐旱性。

为研究Cd2+胁迫下脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)甘露糖集合凝集素(MBL)在肝胰腺中表达量的变化特征,本研究利用重金属镉(Cd2+)对脊尾白虾进行96 h急性毒性实验。实验共设置5组Cd2+浓度胁迫(0、0.01、0.0175、0.021和0.0278mmol/L),分别在Cd2+胁迫后0、3、6、12、24、48、72和96h共8个时间点取样。实时荧光定量结果显示,高浓度Cd2+(0.0175、0.021和0.0278 mmol/L)胁迫下,脊尾白虾MBL基因的表达量先呈上升趋势,在72 h达到峰值后随后下降,但各时间点表达量均与对照组存在显著性差异(P

为研究野大豆TIFY家族基因在野大豆耐盐碱过程中的分子特性及表达特性,以极度耐盐碱野大豆G07256的c DNA为模板,结合前期转录组数据,采用同源克隆的方法,获得了Gs TIFY6B基因,其全长CDS大小为1 047 bp。Gs TIFY6B蛋白编码348个氨基酸,分子量为36. 8 ku,等电点为9. 12,是一个不稳定蛋白。系统进化树分析结果显示Gs TIFY6B与大豆、绿豆、木豆和蔓花生的TIFY家族蛋白同源关系最近,含保守域TIFY和Jas。采用荧光定量PCR技术检测Gs TIFY6B在野大豆不同部位以及盐碱胁迫和激素处理下的转录水平,结果表明,Gs TIFY6B在根中相对表达量最高;在盐胁迫处理下,Gs TIFY6B在野大豆根和叶中的表达量均表现出上调;在碱胁迫处理下,Gs TIFY6B在野大豆叶和根中的表达量表现出先下调后上调表达,推测该基因可能参与野大豆盐碱胁迫防御反应;在ABA胁迫处理下,Gs TIFY6B在野大豆的根中表现出下调表达,而在叶中6,12 h出现上调表达;在MeJA胁迫处理下,Gs TIFY6B在根中先下调后上调表达,而在叶中表现出上调。研究表明,Gs TIFY6B可能通过参与ABA和MeJA信号通路积极响应盐碱胁迫,对后期研究野大豆耐盐碱的分子机制提供了理论基础。

为了分析花生中蛋白磷酸酶2C基因(PP2C)的情况,对耐盐花生突变体(S2)和对照(S4)在胁迫处理前后的叶片进行RNA-Seq分析。通过生物信息学分析筛选出了79个具有完整开放阅读框的PP2C基因,它们位于花生A组野生种的10条染色体上,不同染色体上的PP2C基因数目差异很大,分布为1~15个。根据拟南芥中的PP2C基因的聚类分析结果,79个花生PP2C基因能聚到已报道的12个亚族15个亚类。为了分析这些PP2C基因对盐胁迫响应情况,利用突变体S2和对照S4构建了盐胁迫处理前后的表达谱,筛选出35个受盐胁迫诱导表达的PP2 C基因,涉及12个亚族14个亚类,其中A亚族b亚类、G亚族b亚类、I亚族、L亚族所有成员均受盐胁迫诱导表达;而G亚族a亚类的所有成员均不受盐胁迫诱导表达。对这35个PP2C基因的启动子研究发现,绝大多数PP2C基因的启动子存在多种胁迫响应元件:如与高温胁迫相关的调控元件HSE、与干旱诱导相关的MYB转录因子结合位点MBS、逆境胁迫应答元件TC-rich repeats、与抗氧化反应相关的ARE元件等。为花生PP2C基因的功能研究和利用奠定了基础。

为探究大豆LIM转录因子家族基因在应答盐胁迫中的功能，利用生物信息学方法，根据大豆全基因组数据，共鉴定出21个LIM基因，命名为GmLIM01～GmLIM21,分析大豆LIM基因家族的染色体位置、蛋白质的理化性质、进化关系、保守基序以及对非生物逆境胁迫的响应。结果表明，这些GmLIM基因在大豆20条染色体中的14条染色体上分布不均，片段重复是大豆LIM家族扩大的主要原因。根据系统发育进化分析，大豆21个LIM基因可分为5个亚家族，与其他9个物种的LIM基因一起构建进化树，也可分为5个亚家族。大豆的21个GmLIM基因共包含10个基序，大部分LIM蛋白含有motif 1、motif 2和motif 4这3个保守基序。此外，顺式调控元件的分析表明，在GmLIM基因的启动子序列中，与光响应、生长发育、植物激素和非生物逆境胁迫应答相关的调控元件非常丰富。定量PCR结果表明，在盐胁迫处理后大豆叶和根中GmLIM07、GmLIM17基因的表达量分别在3和6 h达到峰值，后随着处理时间的加长表达量下降。综上GmLIM基因在大豆的盐胁迫应答过程中具有重要的调控作用。

【目的】茉莉酰氨基酸结合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase,JAR1)可以催化茉莉酸(jasmonic acid,JA)形成茉莉酸的活性形式茉莉酸异亮氨基酸复合体(jasmonic acid-isoleucine,JA-Ile)，从而激活JA信号途径。JA信号途径在介导植物盐胁迫的响应中发挥重要作用，因此，探究AtJAR1在植物耐盐性中的功能对于研究JA信号途径影响植物耐盐性的机制具有重要作用。【方法】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，创建了2个不同的拟南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突变体，并对这2个突变体进行地上部生物量的统计分析和JA信号标记基因的表达分析，以确定AtJAR1基因功能缺失。之后，观察分析不同浓度氯化钠和脱落酸(ABA)处理对jar1突变体的种子萌发和幼苗建成的影响，明确AtJAR1基因对拟南芥耐盐性的影响。最后，通过比较分析盐处理前后野生型和突变体的钾离子(K~+)和钠离子(Na~+)质量摩尔浓度，以及高亲和力K~+转运蛋白基因AtHAK5的表达变化情况，初步探究AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能。【结果】JA信号标记基因AtVSP1和AtVSP2的表达量大幅下调，表明AtJAR1基因功能丧失。与点突变产生的jar1#1突变体不同的是，这2个突变体表现为前3周生长加快，之后逐渐减缓并出现叶片萎蔫的表型。同时，AtJAR1突变可以缓解盐胁迫和ABA对种子萌发和根系生长产生的抑制作用。此外，盐胁迫下AtJAR1突变可以促进AtHAK5的表达和根系对K~+的吸收转运。【结论】JA信号途径可能通过与ABA交互作用影响AtHAK5的表达量，以调节植物根系对K~+的吸收转运，进而改变细胞内K~+/Na~+平衡，最终影响植物耐盐性。图8表2参52

【目的】对大豆(Glycine max)水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为Gm SABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在...

生长素响应因子(ARF)是一类具有B3结构域的转录因子，是调节生长素应答反应、控制基因表达的直接分子。前期通过分析转录组数据，在玉米中筛选到1个编码ARF蛋白并积极参与干旱-复水胁迫响应的基因ZmARF10。为进一步研究该基因调控玉米抗旱性的分子机制及抗旱分子育种提供新的思路，首先通过系列生物信息学分析软件对该基因进行生物信息学分析，之后利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ZmARF10在玉米不同组织中的表达模式，分析在高温、干旱、高盐、ABA胁迫和解除胁迫处理下的表达情况，以及在不同玉米自交系间的表达差异，最后利用CRISPR/Cas9技术分析ZmARF10的功能。结果表明，ZmARF10位于玉米的第3号染色体，编码区全长2 127 bp,编码708个氨基酸，具有典型的B3结构域；该基因ATG上游2 kb区域内含有茉莉酸甲酯、生长素、脱落酸、低温响应等应答元件；系统发育树显示，ZmARF10基因编码的蛋白质与高粱同源蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明，ZmARF10是组成型表达基因，在玉米成熟根中的表达量最高；在高温、干旱、高盐以及ABA等4种胁迫处理下，ZmARF10基因的表达量均显著上调，干旱胁迫后上调倍数最高达8.2倍；干旱胁迫后，ZmARF10基因在抗旱自交系郑36中的表达量上升幅度显著高于干旱敏感自交系B73。观察拟南芥野生型与ARF10缺失型突变体发现，与野生型相比，干旱条件下突变体植株出现叶片萎蔫甚至干死的现象，根系发生卷曲，根系分支数减少，侧根生长发育受阻；测定生理生化指标发现，干旱胁迫后缺失型突变体的相对含水量、叶绿素含量、净光合速率显著低于野生型植株，说明敲除ARF10基因后拟南芥抗旱能力下降。