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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
付永平 张君 王丕武 周海涛 曲静
【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-G...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张志刚 白德朗 陈烈臣 熊兴华 李栒 官春云
丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义.利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEP基因片段,并将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行测序.测序结果表明:扩增片段长576bp,与Yannai报道的PEP基因相应区域的同源性为95%.用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBI121.N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEP表达载体,并通过农杆菌介导法将反义PEP基因转化到...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈克贵 王海燕 张义正
根据已知的甘薯块根贮藏蛋白基因序列, 设计和合成了两对PCR引物。用PCR方法,从南薯88基因组中分别扩增出两种DNA片段: 一种含有贮藏蛋白基因启动子和核糖体结合序列(SP2);第二种不仅含有第一种DNA片段的全部序列,而且还有贮藏蛋白的信号肽编码序列(SP1)。核苷酸序列分析表明,这两种DNA片段的启动子和核糖体结合区虽然具有很高的同源性(82% ), 但它们并不相同。在SP1和SP2 的基因启动子区都存在几种典型的保守序列, 如受糖诱导调控的蔗糖盒(Suc-box),CAAT盒和TATA盒。用这两种DNA片段分别构建了可调控的甘薯高效表达载体。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴庭才 李银聚 张春杰 程相朝
将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹随忠 姚学萍 崔亚飞 杨德英 雍康 余树民 刘宗平
【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张晶晶 刘凤军 彭淑英 宋红卫 张涌
构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵凯琴 罗延青 俎峰 王敬乔 李劲峰 陈苇 张云云 杨清辉
【目的】通过表达外源GlgC基因增加甘蓝型油菜种子淀粉积累,从而可能增加含油量,为油菜高含油量育种提供一种潜在的新途径。【方法】本研究将定点突变的大肠杆菌AGPase基因GlgC分别和2个种子特异表达启动子DOF(拟南芥球形胚阶段启动子)、Cruc(油菜种子特异蛋白启动子)重组,构建2个GlgC过表达载体pMB-DOF-TG和pMB-Cruc-TG。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。【结果】PCR及半定量RT-PCR检测结果显示,GlgC基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。【结论】获得了甘蓝型油菜转GlgC基因阳性株,为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
李群 王学英 李贺 刘野 阮成江
利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)的基因组DNA和拟南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA中分别扩增种子特异启动子napin和二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因片段,并将它们依次插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的DGAT基因植物表达载体p1390ND,冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,PCR检测结果证明,重组质粒p1390ND已成功导入农杆菌细胞。该载体可应用于油料能源植物种子含油量的遗传改良。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
徐广博 李政 赵惠贤 刘香利 赵洁 刘丹 吴静
选择标记基因安全性问题是限制转基因植物商品化种植的重要因素。为了从转基因后代中诱导性剔除选择标记基因,本研究克隆了拟南芥热激蛋白Hsp18.2基因启动子,并构建了Hsp18.2启动子诱导表达的CinH/Rs位点特异性重组删除植物表达载体。结果表明,利用农杆菌介导法进行了烟草转化,转化后的烟草经过除草剂筛选和PCR检测,得到转基因阳性植株。本研究为利用位点特异性重组建立植物无标记基因转化体系奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
鲍文蕾 李彬 侯鑫 刘俊娥 郭旭东 王志钢 刘东军
【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV(6.3 kb)。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基...
[期刊] 华北农学报
[作者]
郑醒 张彩英 常文锁 李喜焕
在克隆获得磷高效相关转录因子基因GmPTF1的基础上,构建基因的超表达载体pGN-GmPTF1和无标记(Marker-free)表达载体pX6-GmPTF1;利用农杆菌介导子叶节与花粉管通道转化技术,将表达载体pGN-GmPTF1和pX6-GmPTF1分别转入冀豆12、冀豆16和五星1号大豆品种。转化后的大豆植株经PCR检测,有11株转化植株可扩增出目的条带,其中5株转有pGN-GmPTF1载体和6株转有pX6-GmPTF1载体,表明GmPTF1转录因子基因已初步整合至大豆基因组中。
关键词：
大豆 转录因子 载体构建 遗传转化
[期刊] 华北农学报
[作者]
张红心 王桂兰 陈超 赵璞 马春红
为研究细胞分裂素在水稻籽粒发育中的作用,构建了p1300-p PG-5α-IPT-Nos植物表达载体,并对水稻进行遗传转化。以水稻品种9311为材料,采用PCR法获得种子中特异表达的PG-5α基因启动子,并将此启动子与p1300相连接,构建p1300-p PG-5α载体,用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切p SG516,获得IPT-Nos核酸片段,然后将此核酸片段插入到p1300-p PG-5α中,构建p1300-p PG-5α-IPT-Nos植物表达载体。以水稻品种日本晴愈伤组织为材料,采用农杆菌介导的方法进行遗传转化。成功构建了植物表达载体p1300-p PG-5α-IPT-Nos,获得了阳性率为...
[期刊] 华北农学报
[作者]
邢蔓 谭太龙 李健 邬贤梦 官春云 熊兴华
为提高油菜含油量，构建了基于油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（ＰＥＰＣ）的ｉｈＰＲＮＡ植物表达载体。分别从甘蓝型油菜基因组中克隆了种子储藏蛋白ＮＡＰｉＮ基因启动子（３１５ ｂＰ）、ＰＥＰＣ基因的外显子片段（２４６ ｂＰ）及ＰＥＰＣ基因的内含子（７５４ ｂＰ），包含了其剪切位点之前４ ｂＰ和之后１８ ｂＰ片段。通过中间载体ＰｂｌｕＥｓＣＲｉＰｔⅡｓＫ（＋）再构建到Ｐｂｉ１２１中，构成种子特异表达的内含子剪接的ＰＥＰＣ基因的ＲＮＡ干扰载体Ｐ ｂｉ１２１．ＮＰ＋ｉＰ－。利用农杆菌介导法对湘油１５号进行遗传转化，获得卡那霉素抗性转化植株９株，ＰＣＲ检测证实外源片段成功导入其中７株油菜基因组中。对ｔ２种子．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
李群 王学英 刘野 阮成江
利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和酵母INVSc1(Saccharomyces cerevisiae)的基因组DNA中分别扩增获得种子特异启动子napin和3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)基因片段,并将它们分别克隆到pMD18-T载体中。利用中间载体pBluescriptKS将两目的片段插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的GPD1基因植物表达载体p1390NG,并用冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,可应用于油料能源植物种子含...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李夏 戴佳乐 陈子奇 付永平 马建 曲静 王丕武
【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构(Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA)的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301-P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,...
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