【目的】克隆大豆ＭＹＢ转录因子基因，进行序列分析和表达模式分析，并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱（ＤＧＥＰ）数据分析，获得一个ＭＹＢ转录因子ＧＭ ＭＹＢ１１１；以盐胁迫处理的ｃ ＤＮＡ为模板，利用ＲＴ－ＰｃＲ法分离克隆ＭＹＢ基因ｃ ＤＮＡ编码序列；根据ＧＭ ＭＹＢ１１１蛋白序列进行同源性搜索，得到与ＧＭ ＭＹＢ１１１蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列；使用ＭＥＧＡ５．０５对ＧＭ ＭＹＢ１１１蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树；利用实时荧光定量ＰｃＲ方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况；利用拟南芥原生质体转．．．

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据分析,获得一个MYB转录因子Gm MYB111;以盐胁迫处理的c DNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因c DNA编码序列;根据Gm MYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与Gm MYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5.05对Gm MYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转...

【目的】探究大豆核因子Gm NF-YA13基因在大豆应对非生物胁迫中的生物学功能,为Gm NF-YA13基因在抗逆育种中的应用奠定基础。【方法】以大豆北豆9号和烟草NC89的种子为供试材料,将大豆培养至第一片三出复叶展开后,分别进行干旱、高盐、低温和脱落酸(ABA)处理,通过实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)对Gm NFYA13在以上4种非生物胁迫下的相对表达量进行检测,并对Gm NF-YA13进行克隆及生物信息学分析,将Gm NFYA13转化烟草,并对转基因烟草中抗逆相关基因(Nt ABA2、Nt Osmotin、Nt APX2、Nt SOD、Nt CAT1和Nt Ca MK3)的表达量进行q RT-PCR检测。【结果】干旱、高盐、低温和ABA处理均能不同程度诱导Gm NF-YA13的表达,其中干旱胁迫和ABA处理对Gm NF-YA13的诱导效果尤为显著。Gm NF-YA13位于大豆基因组13号染色体,开放阅读框915 bp,编码含有304个氨基酸的蛋白质,该蛋白质分子量75.14 ku,等电点5.10。Gm NF-YA13蛋白序列包含一个保守的DNA结合结构域。蛋白系统进化分析结果表明,Gm NF-YA13与Gm NF-YA7和拟南芥At NF-YA1亲缘关系较近。启动子顺式作用元件预测分析结果表明,Gm NF-YA13启动子区含有3个ABA响应元件ABRE、1个厌氧诱导元件ARE、1个防御和胁迫反应元件TC-rich repeats及1个干旱诱导的MYB转录因子结合位点MBS。Gm NFYA13在大豆叶片中的相对表达量最高。同时构建Gm NF-YA13植物表达载体,并将Gm NF-YA13转化烟草,获得3株转基因烟草植株。转基因烟草中抗逆相关基因表达量检测结果显示,转基因烟草中的Nt ABA2、Nt Osmotin和NtAPX2相对表达量均显著高于野生型烟草,转基因烟草中Nt SOD、Nt CAT1和Nt Ca MK3的相对表达量与野生型烟草差异不显著。【结论】Gm NF-YA13与大豆干旱、高盐、低温等非生物胁迫之间关系密切,Gm NF-YA13可能通过促进抗逆相关基因表达量的升高以提高转基因烟草的抗逆性。

[目的]本文旨在研究MYB类转录因子基因GmMYB46的结构特征和定位,并阐述其对不同胁迫的响应,为明确其在逆境胁迫下的作用奠定基础。[方法]从大豆品种‘晋豆21’中克隆出GmMYB46的CDS序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行分析,并利用PlantCARE软件分析GmMYB46基因启动子元件。通过洋葱表皮细胞瞬时表达系统对GmMYB46蛋白质全长及不同结构域M1(aa1～123)和M2(aa124～334)进行亚细胞定位分析。采用实时荧光定量PCR检测GmMYB46在不同逆境处理下的表达情况。[结果]GmMYB46 CDS序列全长为1 005 bp,编码334个氨基酸,蛋白质相对分子质量为82.53×10~3,氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。进化树分析表明该基因编码的蛋白与野生大豆Gs MYB46亲缘关系最近。GmMYB46包含MBS、ABRE、GARE、TCA、LTR等逆境胁迫应答元件。亚细胞定位结果显示,p BIN-GmMYB46-GFP及p BIN-GmMYB46M1-GFP融合蛋白在细胞核中表达,p BIN-GmMYB46M2-GFP绿色荧光遍布整个细胞。实时荧光定量PCR分析表明,在干旱、盐(200 mmol·L~(-1)NaCl)、低温(4℃)、ABA(200μmol·L~(-1))、SA(500μmol·L~(-1))、GA(100μmol·L~(-1))处理下均能诱导GmMYB46基因在大豆根、茎、叶中的上调表达。[结论]GmMYB46基因的保守结构域对亚细胞定位起决定性作用,该基因可能参与大豆对非生物胁迫的响应。

NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)域蛋白是植物特有的最大的转录因子家族之一,在调节衰老,细胞分裂,木质形成,生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。本研究从胡杨中成功克隆出与胁迫相关的基因,并命名为PeNAC045。测序结果表明,PeNAC045基因编码区长度为915 bp,编码304个氨基酸,与毛果杨PtrNAC045的氨基酸一致性为96.05%。对PeNAC045基因在NaCl和干旱胁迫下的表达情况进行了分析,PeNAC045基因的表达受高盐和干旱的强烈诱导。利用PeNAC045的cDNA全长构建表达载体pBI121-PeNAC045-GFP,测序确认后,将重组结构和阳性对照(空载体)...

【目的】BBX (B-box)是锌指结构蛋白转录因子家族中一个重要的亚家族,在植物生长发育、植物信号转导及逆境胁迫响应中具有重要的调控作用。对蜡梅BBX24基因的克隆与分析,有利于丰富植物中对BBX基因家族的认识,为蜡梅抗逆调节机制提供新的理论依据。【方法】以蜡梅转录组数据库中获得的蜡梅CpBBX24基因cDNA序列为基础克隆基因全长,使用DNAStar和MEGA进行序列分析和进化树构建。采用qRT-PCR进行蜡梅不同组织及不同花期表达特性分析,以及ABA、 MeJA、干旱、高盐、高温和低温等处理后表达分析。同时,使用Gateway技术构建植物表达载体,花絮侵染法转化拟南芥,对T3代纯合系进行表型观察及非生物胁迫耐性分析。【结果】获得CpBBX24的cDNA序列长为1 374 bp,包含729 bp的开放阅读框(ORF),编码242个氨基酸,分子量为26.54 kD,等电点为4.93。序列分析表明CpBBX24蛋白在N端有两个串联的B-box结构域,其C端不包含CCT结构域。表达特性分析表明,CpBBX24在蜡梅根、茎、子叶、幼叶、成熟叶各器官,外瓣、内瓣、雌蕊、雄蕊等组织中均有表达,其中在子叶中表达量最高。在不同开花时期,CpBBX24表达呈波动变化,在衰老期表达量最高。ABA、MeJA、干旱、高盐、高温和低温均能诱导CpBBX24基因的表达,表达趋势各有差异。在PEG(30%PEG-6 000)、高盐(300 mmol·L~(-1) NaCl)、高温(42℃)、低温(4℃)胁迫下,转基因拟南芥处理后植株总体生长状态优于野生型,相对电导率和丙二醛浓度数值显著低于野生型,说明CpBBX24基因过表达增强了拟南芥的干旱、高盐、高温及低温胁迫耐性。【结论】ABA、MeJA、干旱、高盐、高温和低温等处理诱导了CpBBX24的表达,说明其可能参与蜡梅的逆境胁迫耐性调控。CpBBX24的过表达增强了拟南芥的干旱、高盐、高温及低温等胁迫耐性。这些结果表明CpBBX24基因在干旱、高盐、低温和高温等胁迫响应中发挥重要作用。

【目的】TATA框结合蛋白相关因子TAF10作为基本转录因子之一,在生长发育和胁迫响应过程中发挥着广泛的、重要的生物学作用。对蜡梅中TAF10同源基因CpTAF10的克隆与功能分析,有利于丰富对植物TAFs基因功能的认识,并为解析蜡梅抗逆形成的转录调节机理提供新的理论依据。【方法】以转录组数据库中获得的蜡梅TAFs家族基因序列,克隆得到CpTAF10基因的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用实时荧光定量PCR技术分析CpTAF10基因在蜡梅不同组织及花期中的表达特性,以及高温、低温、盐胁迫及ABA处理后的表达变化。同时,构建CpTAF10基因的过表达载体,采用花序侵染法进行拟南芥遗传转化,对拟南芥转基因纯合株系进行表型观察和胁迫耐性分析。【结果】获得的CpTAF10基因cDNA序列为712 bp,包含405 bp的开放阅读框(ORF),编码134个氨基酸,蛋白理论分子量为15.21 kDa,预测的等电点pI值为5.19。CpTAF10蛋白序列与其他植物同源序列具有较高的同源性,蛋白多序列比对显示CpTAF10蛋白属于TAF10同源蛋白,并含有组蛋白折叠结构域。表达特性分析结果发现,CpTAF10基因在蜡梅的根、茎、子叶、幼叶、成熟叶和花6个不同组织中均有不同程度的表达,其中,在成熟叶中的表达量最高。CpTAF10在蜡梅花朵的不同花期中,呈现出波动的表达模式,在衰老期表达量最高。在低温、盐胁迫和ABA处理的蜡梅叶片中均能被诱导表达,但其表达变化各不相同。在拟南芥中过表达CpTAF10基因可提高盐胁迫下拟南芥种子的萌发率,相对于野生型植株,转基因植株的主根和侧根在盐胁迫下均表现出一定的生长优势。【结论】CpTAF10基因能在低温、盐胁迫和ABA处理后诱导表达,可能参与蜡梅逆境胁迫耐性的分子调控。在拟南芥中过表达CpTAF10基因显著提高了转基因拟南芥的萌芽率及主根和侧根的生长优势,在一定程度上可增强植物的盐胁迫耐性。

【目的】非生物逆境是制约小麦生产的主要因素。ＷＲＫＹ转录因子是植物特有的转录因子家族，参与对多种非生物逆境胁迫的应答。普通小麦基因组中至少含有２００个ＷＲＫＹ，目前仅对少数成员的功能进行了鉴定。通过克隆小麦ＷＲＫＹ转录因子ＴａＷＲＫＹ３５并揭示其功能，为改良小麦的抗逆性提供基因资源。【方法】利用小麦全长ｃＤＮａ数据信息，从强抗旱小麦品种旱选１０号中克隆逆境胁迫应答转录因子基因ＴａＷＲＫＹ３５；采用实时定量ＰｃＲ技术，分析目标基因在不同发育时期、不同组织器官中的表达水平，以及在ＰＥＧ－６０００、Ｎａｃｌ、ａＢａ和低温等逆境胁迫下的表达模式；构建目标基因与ＧＦＰ融合的表达载体，转化小麦原生质体，以．．．

bZIP(basic region/leucine zipper motif)是一类在真核生物中分布广泛的超大转录因子家族,参与调节植物的生长发育、衰老、激素调控、能量代谢、病原防御等过程。胡杨是研究抗逆分子机制的模式木本植物,但是关于胡杨的b ZIP功能迄今未见研究报道。本研究从胡杨中克隆得到PebZIP26和PebZIP33两个转录因子的c DNA,经分析,分别编码439与371个氨基酸且PebZIP26与PebZIP33基因的表达受干旱、脱水及盐胁迫诱导。构建植物表达载体,利用农杆菌花序侵染法转化拟

【目的】克隆新的植物MYB转录因子基因,进行序列分析,并对其功能进行初步鉴定。【方法】RT-PCR法结合RACE-PCR法分离克隆MYB基因cDNA全长序列;酵母系统检测其转录激活活性;半定量RT-PCR检测目的基因在植物体中的表达情况,及对类黄酮代谢途径中生物合成酶的影响。【结果】根据植物中MYB基因DNA结合域保守区设计简并引物,以大豆品种中豆27的叶片为材料,RT-PCR扩增出两个MYB基因同源片段;据此设计基因特异引物,通过RACE-PCR分离克隆出两个新的MYB基因GmMYBZ1、GmMYBZ2。酵母系统检测表明,GmMYBZ2具有转录激活功能,β-半乳糖苷酶活性为10.35U;半定...

【目的】对大豆(Glycine max)水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为Gm SABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在...

【目的】植物激素乙烯参与植物的生长发育以及生物与非生物胁迫过程。组成型三重反应基因CTR1作为乙烯受体下游一个负调控因子,结合乙烯受体共同参与乙烯的信号转导途径。本研究通过对大豆(Glycine max)的组成型三重反应基因CTR1进行克隆和诱导表达分析,以及在大豆发状根中过表达该基因后进行疫霉根腐病的抗性分析,探究CTR1在大豆与疫霉菌互作过程中的功能。【方法】利用同源克隆的方法,以拟南芥的AtCTR1序列为探针,在大豆基因组数据库中搜索同源性最高的基因即为大豆的GmCTR1(Glyma.13G1511

MYB转录因子广泛参与植物的生长、发育、生理代谢的调控及胁迫应答,它们均具有保守的MYB结构域。GmMYBJ7是从大豆中分离获得的一个新的MYB基因(GenBank登录号:DQ902864)。亚细胞定位检测结果表明,Gm-MYBJ7蛋白定位于细胞核中;半定量RT-PCR检测结果显示,在紫外辐射、高盐及干旱(PEG)等非生物胁迫处理下,GmMYBJ7在大豆品种吉林3号中的表达量明显降低;构建植物表达载体pCAMBIA2301-GmMYBJ7,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,在GmMYBJ7的阳性转化受体中,总黄酮的含量则明显减少。推测GmMYBJ7可能通过对类黄酮生物合成的调控参与植物的基础生...

【目的】克隆橡胶树转录因子HbERF1,分析其在橡胶树中响应非生物胁迫的表达模式,并通过在拟南芥中过表达鉴定其生物学功能,为橡胶树抗逆育种提供基因储备。【方法】利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆到HbERF1全长序列,通过qRT-PCR技术分析其在非生物胁迫下的时空表达特性;通过农杆菌介导法转化拟南芥,利用Southern杂交和qRT-PCR技术对过表达植株进行鉴定,并分析过表达植株在干旱、高盐和PEG等胁迫条件下的表型及相关基因的表达特性,验证HbERF1的生物学功能。【结果】橡胶树转录因子HbERF1没有内含子,GenBank登录号为JQ914647,cDNA序列全长为1 178 bp,包...

【目的】WRKY转录因子与植物的生物和非生物胁迫应答密切相关。通过对大豆WRKY转录因子基因GmWRKY148的克隆及在大豆发状根中过表达后对疫霉根腐病抗性的分析,探究大豆与大豆疫霉菌互作的作用机理。【方法】以拟南芥的AtWRKY44序列为探针,利用同源克隆的方法在大豆Williams 82的根部组织中得到其同源基因Glyma.14G199800,命名为GmWRKY148。对GmWRKY148蛋白进行系统进化树分析;利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的根、茎、叶、子叶和接种大豆疫霉菌不同时间点的转录水平;利用双酶切的方法将GmWRKY148完整的CDS序列连接到植物过表达载体p Bin GFP2中,利用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,进行亚细胞定位分析。利用发根农杆菌K599介导的遗传转化体系,经过GFP荧光筛选和qRT-PCR检测,获得大豆过表达GmWRKY148的阳性发状根(OE-GmWRKY148)和转入p Bin GFP2空载体(EV)的阴性对照发状根。对过表达GmWRKY148发状根和阴性对照发状根接种大豆疫霉菌,统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况。【结果】GmWRKY148的CDS序列全长为999 bp,编码332个氨基酸,等电点为7.61。系统进化分析发现,GmWRKY148与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的WRKY转录因子亲缘关系十分相近,且与菜豆的亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,GmWRKY148定位在细胞核中。组织表达分析显示,GmWRKY148在根中的表达量最高,在茎和叶中次之,在子叶中最低。荧光定量PCR结果表明,接种大豆疫霉菌P6497后,在感病品种Williams和抗病品种Williams 82(含有Rps1k)中,GmWRKY148受诱导逐渐上调表达,在侵染24 h后表达水平均达到最高,但在Williams 82中的上调倍数更高。对过表达GmWRKY148和转空载体的大豆阳性发状根分别接种大豆疫霉菌P6497的菌丝块,比较接种24 h后的病斑长度和疫霉积累量,结果显示,与对照EV相比,过表达GmWRKY148大豆阳性发状根的病斑长度显著变短,疫霉积累量显著降低。对过表达GmWRKY148和EV的大豆阳性发状根分别接种疫霉菌P6497的游动孢子,并在接种后24、36和48 h用显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量,统计结果显示,过表达GmWRKY148的大豆阳性发状根与对照EV相比,菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低。【结论】GmWRKY148参与调控大豆与大豆疫霉的互作,能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。