根据NCBI中大豆fad2-1序列设计引物,用PCR方法从大豆的基因组DNA中扩增大豆脂肪酸脱饱和酶基因,克隆到pMD18-Tvector中,转化大肠杆菌JM109菌株,进行测序与比对。然后,将其反向克隆到表达载体pBt,转化农杆菌菌株LBA4404,经双酶切鉴定和PCR扩增检测,获得具有该基因的农杆菌工程菌。结果表明,克隆的fad2-1基因为1 196 bp,基因序列与NCBI中已发表的fad2-1序列只有4%的差异,相似性大于95%,说明克隆的基因是大豆fad2-1基因;构建了该基因的反向表达载体,转入农杆菌内。这为利用农杆菌介导法把该反义基因转入大豆,改良脂肪酸成分奠定了基础。

【目的】对芝麻△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因SiSAD(△9 stearoyl acyl-carrier-protein desaturase)进行克隆与表达分析,并转入拟南芥,探究其在油酸合成过程中的作用,为芝麻油酸含量的遗传改良提供分子基础。【方法】提取中芝13叶片的总RNA,反转录为cDNA。根据芝麻基因组数据库中的SiSAD序列信息(序列号为SIN_1008977)设计引物,以cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得SiSAD编码区序列,并与参考基因组序列进行比较。利用InterPro进行保守结构域分析,获得SiSAD蛋白的保守结构域。利用BLAST对SiSAD蛋白进行同源对比,获得SiSAD的同源蛋白质。采用邻接法构建系统进化树,获得芝麻SAD蛋白与橄榄、牵牛花、蓖麻、莴苣、葡萄、柑橘、拟南芥等植物SAD蛋白的亲缘关系。通过荧光定量PCR检测SiSAD在2个芝麻品种中芝33和中丰芝一号的根、茎、叶、蕾和种子中的相对表达量,分析SiSAD的表达特异性。将SiSAD连接过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥(Col-0),筛选阳性后代,对T3代转基因和野生型的拟南芥种子中硬脂酸和油酸相对含量进行测定,分析SiSAD的功能。【结果】成功获得SiSAD的编码区序列,与参考基因组序列一致,全长为1 152 bp,编码383个氨基酸,SiSAD蛋白的分子量为43 kD,等电点为6.18。发现SiSAD蛋白含有一个保守结构域,属于脂肪酸去饱和酶家族成员,与其他植物的SAD蛋白质序列的同源性较高,暗示SiSAD在不同物种中的功能可能比较保守。系统进化分析显示,芝麻SAD蛋白与牵牛花和橄榄的SAD蛋白处于同一分支,进化关系较近,与蓖麻、拟南芥、柑橘的SAD蛋白亲缘关系较远。荧光定量PCR结果表明,SiSAD在芝麻种子中的表达量远远高于其他组织,有显著的组织特异性。成功构建了SiSAD的过表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,结果表明SiSAD成功导入拟南芥中,而且转录水平很高。对T3代转基因拟南芥种子中硬脂酸和油酸的相对含量分析表明,与野生型拟南芥比较,3个转SiSAD拟南芥株系中硬脂酸(C18:0)含量分别降低了3.0%、4.8%和6.1%,而油酸(C18:1)含量分别升高了2.8%、4.3%和7.8%,平均升高4.97%。【结论】克隆获得芝麻SiSAD的全长cDNA序列,鉴定了SiSAD的功能,发现SiSAD在油酸合成代谢过程中正向增加油酸含量,可应用于高油酸芝麻新品种培育。

以枣树鲜食品种鸡蛋枣为材料,通过根癌农杆菌介导ACC合成酶反义基因转化,得到了转基因植株.预培养1d的枣树幼嫩茎段经根癌农杆菌感染后共培养3d,转移至分化选择培养基MS(1/2NO3)+0.15mg/LNAA+1.75mg/LZT+10mg/LKm+500mg/LCarb上诱导产生不定芽,将抗Km不定芽先后在15mg/LKm的生长、增殖和生根培养基上继续选择,诱导成完整植株.经PCR检测从抗Km植株中选择到7株阳性植株,进一步经Southern杂交证实有6株外源基因已整合到了枣树基因组中.Real timePCR定量检测表明,ACC合成酶反义基因在5株转基因植株中得到表达.

硬脂酰－酰基载体蛋白脱饱和酶是植物脂肪酸合成代谢的关键酶，直接调节膜脂和贮脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。本研究通过ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术，克隆乌桕硬脂酰－酰基载体蛋白脱饱和酶（ＳＳＳＡＤ）的ＣＤＮＡ全长序列。结果显示，该序列包含１个１１９１ ｂＰ的完整的开放阅读框（ＧＥＮｂＡＮｋ登录号为ＥＦ０７９６５５），编码３９６个氨基酸，含３３个氨基酸的叶绿体转移肽。其成熟肽含有３６３个氨基酸，推测其分子量为４１．５ ｋＤＡ，等电点为５．４２。同源性分析及同源建模数据显示ＳＳＳＡＤ和其它物种的ＳＡＤ有较高的同源性，含有１个保守结构域。构建原核表达载体ＰＭＡＬ－ＳＳＳＡＤ，转入大肠杆菌ＤＨ５α，并．．．

采用生物信息学方法对已在GenBank上注册的木薯、木油桐、蓖麻、麻风树、油桐和天山雪莲的△9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)核酸序列以及推导的氨基酸序列、组成成分、导肽、跨膜拓扑结构、疏水性、亲水性、蛋白质二级结构与功能域及三维结构进行分析预测和推断.结果表明:木薯、木油桐、蓖麻、麻风树、油桐和天山雪莲的SAD核酸序列以及推导的氨基酸序列、组成成分均比较一致;木薯SAD存在叶绿体转运肽,天山雪莲SAD存在线粒体目标肽,均无跨膜结构;α-螺旋和无规卷曲是该蛋白质二级结构的主要结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,只有一个功能结构域位于第6...

为了研究海水鱼合成高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids,HUFAs)的关键酶,本研究克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)的△6脂肪酸去饱和酶的部分cDNA序列。根据GenBank已公布的其他鱼类的△6脂肪酸去饱和酶cDNA序列进行分析,设计了一对用于PCR扩增军曹鱼的△6脂肪酸去饱和酶基因保守序列的引物;然后以军曹鱼肝总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出一段长度为743bp的片段,该片段经纯化后,连接至pMD18-T载体上进行测序。结果显示,该片段与欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)△6脂肪酸去饱和酶基因的...

利用RNAi原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(GenBank:AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500 bp的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi载体pCAMBIA1301-Afad12Ri。

研究了温度、光照和酸碱度对三角褐指藻、小球藻和球等鞭金藻-ω3脂肪酸去饱和酶基因表达的影响。实时定量PCR结果表明,10和15℃的低温处理,降低了3种微藻ω-3脂肪酸去饱和酶基因的表达丰度,提高处理温度至25和30℃(三角褐指藻除外),则促进该基因的转录;在5 000 lx的光照强度下处理48和72 h,可以提高3种藻类的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的表达;酸碱度对3种微藻-ω3脂肪酸去饱和酶基因的表达影响与不同的物种有关,pH 5~9的培养结果显示,酸碱度对三角褐指藻影响较大,球等鞭金藻次之,而对小球藻影响较小。

根据中华绒螯蟹FAD9基因cDNA序列(Accession Number:JQ693685)设计引物,扩增得到中华绒螯蟹FAD9基因的开放阅读框(ORF),用原核表达载体p Cold-TF DNA成功构建重组表达载体p Cold-fad9,将p Cold-fad9转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S,在异丙-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下进行表达。SDS-PAGE分析表明,诱导后出现的特异性蛋白条带,大小与预期理论值(95.10 k D)相符。当IPTG浓度为0.3 mmol/L时,在15℃条件下诱导20 h,重组蛋白的表达量最高。目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。利用...

采用脲素包合法对华山松籽油中的不饱和脂肪酸进行了分离,并对其主要成分及降血脂作用进行了研究。结果表明,华山松籽油中的不饱和脂肪酸组成为亚油酸915.3g/kg,油酸60.7g/kg,亚麻酸4.0g/kg。华山松籽油不饱和脂肪酸中剂量组和高剂量组小鼠血清中甘油三酯(TG)水平显著或极显著低于高脂模型组(中剂量组P<0.05,高剂量组P<0.01);低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠血清中总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平及动脉硬化指数(AI)显著或极显著低于高脂模型组(低剂量组P<0.05,中、高剂量组P<0.01);中剂量组、高剂量组小鼠血清中高密度脂蛋白(HDL-C)水平显著或极...

以油菜子叶节为外植体优化了农杆菌介导的甘蓝型油菜的遗传转化体系,为在油料作物中用基因工程手段生产γ-亚麻酸打下基础。采用CaCl2法制备农杆菌AGL1感受态细胞,将已经构建好的植物表达载体pPZP221(35S-D6D-NOS)通过液氮冻融法转化农杆菌,PCR筛选阳性转化子。结果表明:优化的甘蓝型油菜子叶节外植体预培养条件是:MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基预培养2 d;用于侵染的农杆菌菌液的最适浓度为OD600=0.4,时间为5 min,并得到转基因植株。经侵染的外植体在含有庆大霉素的分化选择培养基上培养,抗性芽移至生根培养基,PCR检测阳性小植株移栽花盆,共...

鱼油中n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)是以甘油酯形式存在的。本文对鱼油保健品中n-3PUFA存在形式的选择,利用生物酶技术富集n-3PUFA的方法如脂肪酶选择性水解、脂肪酶选择性酯交换和脂肪酶选择性酯化进行了详细的综述,并对n-3PUFA甘油酯的前景进行了展望,为进一步开发n-3PUFA甘油酯产品提供参考。

瘤胃微生物对饲料源性不饱和脂肪酸(Unsaturated fatty acid,UFA)的生物氢化作用,限制UFA向反刍动物产品中转化的效率,从而使乳脂肪酸组成的调控难以达到理想的效果。UFA作为一类具有独特作用的生物活性物质,在生物系统中具有广泛的生理功能。下面就瘤胃中UFA氢化发生的原因、参与氢化的瘤胃微生物及氢化的中间产物作一综述。

用正交法对不饱和脂肪酸进行6因素2水平的饲料含量设计，并在对虾营养试验系统中进行饲养实验。结果表明：长毛对虾仔虾的生长率、存活率受不饱和脂肪酸种类与含量的影响。在本实验条件下，长毛对虾仔虾期对C16：n、C18：n、C18：2u、C18：3n、C20：1-5n和C22-24的最适宜含量分别占饲料的0．24％、1．40％、1．85％．0.43％、0．76％和2．25％。

以铁皮石斛原球茎为受体,用农杆菌介导1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)的反义基因对铁皮石斛进行遗传转化,并对影响转化的几个因素进行优化,结果表明:经刀切法处理的原球茎,在AS浓度为100μmol/L、农杆菌菌液OD600值为0.8的条件下侵染30 min,共培养60 h,接种到含有30 mg/L Mer和3.0 mg/L PPT的筛选培养基中,遗传转化效率最高。筛选获得的抗性植株经GUS组织化学染色和PCR鉴定,初步证明ACO反义基因已整合到铁皮石斛的基因组中。