【目的】对大豆(Glycine max)水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为Gm SABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在...

从抗大豆花叶病毒病(SMV)大豆材料科丰1号中克隆到2个编码PR10蛋白的新基因Glyma09g04530和Glyma15g15590,Glyma09g04530和Glyma15g15590基因的ORF全长均为477 bp,编码158个氨基酸。序列比对与系统发生树分析结果表明:Glyma09g04530和Glyma15g15590是大豆中2个编码PR10蛋白的新基因。Glyma09g04530和Glyma15g15590基因在大豆的根、茎及叶中均有表达;接种大豆SMV后,Glyma09g04530和Glyma15g15590基因在大豆科丰1号的叶片中的表达均被强烈诱导并高效表达,显示Glyma...

【目的】硫转运蛋白(sulfate transporter,SULTR)参与根系对外界环境中硫酸根(SO42-)的吸收与转运。大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b在根中特异表达,其功能是将外界的SO42-吸收转运到植物根系中。文章克隆大豆硫转运蛋白GmSULTR1;2b的启动子,研究该启动子的驱动活性和组织表达情况,从而了解GmSULTR1;2b的调控机制,为提高大豆含硫氨基酸含量提供分子依据。【方法】根据NCBI中GmSULTR1;2b的序列,分析预测该基因上游2 259 bp为启动子,并利用在线数据库PLACE和Plant-CARE预测该启动子序列的调控元件。以大豆品种南农N2899的...

电子克隆(In silicocloning)是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。根据物种间同源基因相对保守的特点,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)吡哆醇生物合成蛋白cDNA序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了1 280 bp长的大豆吡哆醇生物合成蛋白的基因序列(GenBank登陆号为DQ139265)。经过RT-PCR扩增、基因组PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,20~955 bp),编码311个氨基酸...

【目的】探讨热激蛋白（HSP）在花楸树响应高温胁迫过程中的作用，以期为花楸树引种低海拔地区提供理论基础。【方法】以2～4年生花楸树实生苗为研究对象，进行了花楸树SpHSP70-3基因的克隆、系统进化分析、组织特异性表达模式以及响应高温胁迫的表达机制研究，并利用农杆菌介导法转化拟南芥，对SpHSP70-3基因在高温胁迫下的响应进行了异源验证。【结果】SpHSP70-3基因开放阅读框全长为2 088 bp，编码695个氨基酸；SpHSP70-3蛋白与蔷薇科梨属的白梨PbHSP70同源性最高。内源性表达分析显示：SpHSP70-3基因在叶片中表达量最高，在花蕾、初花、盛花时表达量偏低；42℃处理花楸树后，发现前6 h SpHSP70-3基因表达量没有显著变化，12 h时表达量增至对照组的12倍，24 h时表达倍数最高，为对照组的19倍。对3个转SpHSP70-3基因拟南芥纯合株系（OE1、OE2、OE3）和野生型拟南芥（WT）进行45℃高温处理后，OE1、OE2、OE3中的丙二醛（MDA）含量均高于WT，且过氧化氢酶（CAT）活性和过氧化物酶（POD）活性结果均低于WT。此外，SpHSP70-3在转基因株系中的表达量随着处理时间的增加而上升，并且其抑制了正调节因子AtHSP70、AtHSP18.2、AtHsfA1D和AtHsfA1A的表达，同时诱导了负调节因子AtHsfB2B的上调表达。【结论】SpHSP70-3在花楸树响应高温胁迫过程中起负调控作用，初步推测SpHSP70-3是花楸树引种低海拔地区响应高温响胁迫机制中的负调控因子。

【目的】探究大豆核因子Gm NF-YA13基因在大豆应对非生物胁迫中的生物学功能,为Gm NF-YA13基因在抗逆育种中的应用奠定基础。【方法】以大豆北豆9号和烟草NC89的种子为供试材料,将大豆培养至第一片三出复叶展开后,分别进行干旱、高盐、低温和脱落酸(ABA)处理,通过实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)对Gm NFYA13在以上4种非生物胁迫下的相对表达量进行检测,并对Gm NF-YA13进行克隆及生物信息学分析,将Gm NFYA13转化烟草,并对转基因烟草中抗逆相关基因(Nt ABA2、Nt Osmotin、Nt APX2、Nt SOD、Nt CAT1和Nt Ca MK3)的表达量进行q RT-PCR检测。【结果】干旱、高盐、低温和ABA处理均能不同程度诱导Gm NF-YA13的表达,其中干旱胁迫和ABA处理对Gm NF-YA13的诱导效果尤为显著。Gm NF-YA13位于大豆基因组13号染色体,开放阅读框915 bp,编码含有304个氨基酸的蛋白质,该蛋白质分子量75.14 ku,等电点5.10。Gm NF-YA13蛋白序列包含一个保守的DNA结合结构域。蛋白系统进化分析结果表明,Gm NF-YA13与Gm NF-YA7和拟南芥At NF-YA1亲缘关系较近。启动子顺式作用元件预测分析结果表明,Gm NF-YA13启动子区含有3个ABA响应元件ABRE、1个厌氧诱导元件ARE、1个防御和胁迫反应元件TC-rich repeats及1个干旱诱导的MYB转录因子结合位点MBS。Gm NFYA13在大豆叶片中的相对表达量最高。同时构建Gm NF-YA13植物表达载体,并将Gm NF-YA13转化烟草,获得3株转基因烟草植株。转基因烟草中抗逆相关基因表达量检测结果显示,转基因烟草中的Nt ABA2、Nt Osmotin和NtAPX2相对表达量均显著高于野生型烟草,转基因烟草中Nt SOD、Nt CAT1和Nt Ca MK3的相对表达量与野生型烟草差异不显著。【结论】Gm NF-YA13与大豆干旱、高盐、低温等非生物胁迫之间关系密切,Gm NF-YA13可能通过促进抗逆相关基因表达量的升高以提高转基因烟草的抗逆性。

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据分析,获得一个MYB转录因子Gm MYB111;以盐胁迫处理的c DNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因c DNA编码序列;根据Gm MYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与Gm MYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5.05对Gm MYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转...

【目的】克隆大豆ＭＹＢ转录因子基因，进行序列分析和表达模式分析，并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱（ＤＧＥＰ）数据分析，获得一个ＭＹＢ转录因子ＧＭ ＭＹＢ１１１；以盐胁迫处理的ｃ ＤＮＡ为模板，利用ＲＴ－ＰｃＲ法分离克隆ＭＹＢ基因ｃ ＤＮＡ编码序列；根据ＧＭ ＭＹＢ１１１蛋白序列进行同源性搜索，得到与ＧＭ ＭＹＢ１１１蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列；使用ＭＥＧＡ５．０５对ＧＭ ＭＹＢ１１１蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树；利用实时荧光定量ＰｃＲ方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况；利用拟南芥原生质体转．．．

采用分子克隆技术克隆了黄羽肉鸡胰蛋白酶原（ＴＲＹ）基因，并运用多种生物信息学软件对ＴＲＹ蛋白质结构和功能进行了分析和预测，研究ＴＲＹ在禽类消化过程中的作用．结果表明：黄羽肉鸡ＴＲＹ基因的开放阅读框全长７４７ ｂｐ，由２４８个氨基酸残基组成，其中包含１５个氨基酸的信号肽（ＭＫＦＬＶＬＶＡＦＬＧＶＡＶＡ）和１０个氨基酸的激活肽（ＦｐＩＳＤＥＤＤＤＫ）；该蛋白分子质量为２６．１ Ｋｕ，含有信号肽，不含有糖基化位点，有１１个磷酸化位点；此外，该蛋白属于疏水性蛋白，但不存在跨膜区．氨基酸序列比对的结果表明：黄羽肉鸡ＴＲＹ具有丝氨酸蛋白酶的保守结构特征，如含有催化三联体氨基酸（组氨酸－６４、天冬氨酸－１１．．．

【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一,由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白(expansin)在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因,并对其结构、组织定位和发育表达特性进行研究,为进一步明确大豆孢囊线虫的寄生、致病机制打下基础。【方法】利用同源基因克隆技术,根据已报道的线虫expansin基因的保守序列设计上下游简并引物,从大豆孢囊线虫2龄幼虫cNDA中克隆expansin基因的EST片段,根据EST片段序列设计RACE特异性引物,通过RACE技术扩增测序后采用DNAstar 7.1和DNAman软件对序列进行比对和拼接,得到大豆孢囊线虫expansin基因c DNA全长;采用CLC sequence viewer 6进行开放阅读框查找、蛋白质翻译和序列比对;使用EBI在线软件Signal P 3.0 Server和TMHMM软件进行预测蛋白质前体信号肽和跨膜结构域预测,GSDS在线软件进行基因组结构分析;使用PHYML软件和MEGA5.0软件最大似然法对获得的基因与其他线虫expansin基因进行比对与系统进化树构建;采用Southern杂交技术分析Hg-exp-1在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数;通过原位杂交技术确定2个expansin基因的表达部位;提取卵、侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫与白雌虫的c DNA作为模板,通过半定量PCR技术分析expansin基因在线虫不同龄期的发育表达特性;根据Hg-exp-1基因序列设计引物扩增并合成dsRNA,对大豆孢囊线虫2龄幼虫浸泡处理24 h后接种大豆植株,分析Hg-exp-1 RNA干扰后对线虫侵染的影响。【结果】从大豆孢囊线虫2龄幼虫中成功克隆出2个扩展蛋白基因全序列,命名为Hg-exp-1和Hg-exp-2,长度分别为1 047和1 037 bp,分别编码长度为288和295个氨基酸的多肽,2个预测蛋白N端均含有信号肽,无跨膜结构域,表明其为分泌型蛋白。序列比对发现大豆孢囊线虫HG-EXP-1序列与马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)GR-EXPB1(CAC83611)和GR-EXPB2(CAC84564)以及非洲茎线虫(Ditylenchus africanus)DA-EXPB1(ADJ57307)等具有高度一致性。Southern杂交分析表明,expansin基因在大豆孢囊线虫中可能以多拷贝方式或多基因家族存在。原位杂交显示它们特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。Hg-exp-1体外RNA干扰后,2龄幼虫浸泡在dsRNA 24 h,靶基因的转录水平下调,接种后大豆根内线虫2龄幼虫数和雌虫数分别下降了38.3%和43.4%。【结论】从大豆孢囊线虫中成功分离鉴定出2个expansin基因,同时明确了其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起重要作用。

为了进一步研究分枝酸变位酶同源效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用机制,对其启动子进行了克隆和功能分析。采用启动子在线软件Promoter 2. 0和Promoter scan分析分枝酸变位酶同源基因的上游序列,寻找其启动子位点和顺式作用元件,然后通过PCR技术克隆预测启动子的DNA序列,构建荧光蛋白GFP融合载体,转化核盘菌,最后通过检测GFP荧光信号来验证启动子功能。经生物信息学分析发现,该效应蛋白基因上游具有启动子序列特征,包含TATA盒和CAAT盒等顺式元件,采用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增,得到了733 bp启动子序列,序列包含相关的启动元件,然后以质粒pBlunt NAT-GFP为基础,将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中,构建得到启动子N-Pro+GFP融合载体,通过REMI技术转化核盘菌原生质体,潮霉素筛选得到了一些转化子,PCR验证融合载体整合到了核盘菌基因组DNA上,最后经荧光显微镜检测到了菌丝GFP荧光信号,结果表明,克隆的分枝酸变位酶同源基因ATG上游733 bp的DNA序列具有启动子功能。

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SA...

以拟南芥为研究对象,根据已知的生物信息数据,通过反向遗传学的方法,对与钴胺素合成相关蛋白CSRP基因进行分子克隆,得到该基因的基因组序列和cDNA序列,构建二元重组质粒,利用根癌农杆菌介导的花浸泡转基因方法分别转化突变体和野生型植株,进行互补试验和过表达试验,筛选转基因植株,并进一步预测其编码蛋白的亚细胞定位于叶绿体中.结果表明,在突变体中转入该基因后,转基因植株恢复野生型的表型,而在过表达的转基因植株中表型更为明显,即生长旺盛,晚花.说明该基因对于拟南芥的营养生长起促进作用,由于其功能预测与钴胺素合成相关的蛋白,推测其可能在植物营养生长中起作用.

【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控,克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA序列,并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE技术从黑麦草(品种"顶峰")中获得LpAQP全长cDNA序列;运用生物信息学软件分析其编码蛋白;构建LpAQP与GFP融合的瞬时表达载体,采用基因枪法转入洋葱表皮细胞,观察其细胞定位;通过real time-PCR分析LpAQP的表达模式,并用Southern杂交分析其拷贝数。【结果】克隆获得LpAQP的cDNA序列,GenBank登录号为JX569791,其开放阅读框(ORF)为867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质分子量为30.7 kD。该基因含...

【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列...