【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克隆出1个果胶酸裂解酶新基因;通过原位杂交和半定量PCR的方法确定基因的表达部位和分析不同发育阶段的基因表达;采用Southern杂交方法分析基因的拷贝数。【结果】从大豆孢囊线虫中克隆出1个全长为957个碱基编码227个氨基酸残基的新果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5(GenBank登录号HQ123259)。Hg-pel-5基因组由2个外显子和1个内含子组成。预测蛋白含有...

【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 S

【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一,由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白(expansin)在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因,并对其结构、组织定位和发育表达特性进行研究,为进一步明确大豆孢囊线虫的寄生、致病机制打下基础。【方法】利用同源基因克隆技术,根据已报道的线虫expansin基因的保守序列设计上下游简并引物,从大豆孢囊线虫2龄幼虫cNDA中克隆expansin基因的EST片段,根据EST片段序列设计RACE特异性引物,通过RACE技术扩增测序后采用DNAstar 7.1和DNAman软件对序列进行比对和拼接,得到大豆孢囊线虫expansin基因c DNA全长;采用CLC sequence viewer 6进行开放阅读框查找、蛋白质翻译和序列比对;使用EBI在线软件Signal P 3.0 Server和TMHMM软件进行预测蛋白质前体信号肽和跨膜结构域预测,GSDS在线软件进行基因组结构分析;使用PHYML软件和MEGA5.0软件最大似然法对获得的基因与其他线虫expansin基因进行比对与系统进化树构建;采用Southern杂交技术分析Hg-exp-1在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数;通过原位杂交技术确定2个expansin基因的表达部位;提取卵、侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫与白雌虫的c DNA作为模板,通过半定量PCR技术分析expansin基因在线虫不同龄期的发育表达特性;根据Hg-exp-1基因序列设计引物扩增并合成dsRNA,对大豆孢囊线虫2龄幼虫浸泡处理24 h后接种大豆植株,分析Hg-exp-1 RNA干扰后对线虫侵染的影响。【结果】从大豆孢囊线虫2龄幼虫中成功克隆出2个扩展蛋白基因全序列,命名为Hg-exp-1和Hg-exp-2,长度分别为1 047和1 037 bp,分别编码长度为288和295个氨基酸的多肽,2个预测蛋白N端均含有信号肽,无跨膜结构域,表明其为分泌型蛋白。序列比对发现大豆孢囊线虫HG-EXP-1序列与马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)GR-EXPB1(CAC83611)和GR-EXPB2(CAC84564)以及非洲茎线虫(Ditylenchus africanus)DA-EXPB1(ADJ57307)等具有高度一致性。Southern杂交分析表明,expansin基因在大豆孢囊线虫中可能以多拷贝方式或多基因家族存在。原位杂交显示它们特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。Hg-exp-1体外RNA干扰后,2龄幼虫浸泡在dsRNA 24 h,靶基因的转录水平下调,接种后大豆根内线虫2龄幼虫数和雌虫数分别下降了38.3%和43.4%。【结论】从大豆孢囊线虫中成功分离鉴定出2个expansin基因,同时明确了其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起重要作用。

【目的】研究克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的序列特征及其编码产物的理化性质、结构特征及同源性等。【方法】根据同源序列相似性设计引物,利用PCR、染色体步移等技术获得了基因序列,并对基因信号肽,疏水性和结构域等进行了分析。【结果】获得克雷伯氏菌2395 bp序列,其中K-PGL基因开放阅读框1710 bp,编码569个氨基酸,分子质量63.37 kDa,等电点7.17。编码蛋白具有信号肽酶切割位点,效率为0.864,序列中不含有半胱氨酸Cys,平均疏水指数为-0.449,为稳定存在的亲水蛋白。基因编码的蛋白具有内切聚半乳糖醛酸裂解酶基因家族特有的保守结构域,进化上与产酸克雷伯氏菌亲缘关系最近。【结论】获得了K-PGL基因序列及其特征,为进一步研究果胶酸裂解酶的生物学功能和应用提供依据。

为使苎麻生物脱胶果胶裂解酶PelG403高效表达。将pelG403从重组质粒pEASY-Blunt E1-G403更换至质粒拷贝数更高的pET28a载体中,导入Escherichia coli BL21(DE3)后进行诱导表达。采用DNS法进行酶活力测定,通过SDS-PAGE和Western Blot分析检验PelG403表达效果,并对其序列进行分析鉴定。结果表明:pET28a-G403/BL21的果胶裂解酶活力为335.8 U/mL,较pEASY-Blunt E1-G403/BL21提高了3.05倍;工程菌pET28a-G403/BL21表达产物分子量比预测带His标签的融合蛋白分子量(43.6 ku)略小;PelG403含387个氨基酸,N末端前35个氨基酸为信号肽;理论pI值为7.64,有4个半胱氨酸,不稳定系数为27.42;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构,属于Pec lyase C家族。因此,将pelG403从重组质粒pEASY-Blunt E1-G403更换至pET28a载体中,并导入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,是苎麻脱胶果胶裂解酶基因pelG403高效表达的方法和途径,同时对其序列进行分析鉴定,为果胶裂解酶的纯化、关键位点分析、分子改造及其脱胶功能特性研究奠定基础。

为了获得高酶活力的苎麻脱胶果胶裂解酶，为后续分子改造和新型苎麻生物脱胶酶制剂复配提供理论依据。将果胶裂解酶基因pel419从重组质粒pEASY-Blunt E1-pel419更换至pET28a载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达；用SDS-PAGE和Western Blot检验pel419基因的表达效果；用生物信息学软件分析Pel419理化表征和系统发育，预测其二级结构、高级结构及关键氨基酸位点。结果表明，工程菌pET28a-pel419/BL21的果胶裂解酶活力为434.4 U/mL,较pEASY-Blunt E1-pel419/BL21提高了1.7倍；Pel419含375个氨基酸，N末端前22个氨基酸为信号肽，理论pI值为6.59,有4个半胱氨酸，不稳定系数为18.20;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构，属于Pec lyase C家族；Pel419的Ca~(2+)结合位点为ASP151、ASP153和ASP192,定位发现3个保守位点均暴露在三维空间的表面，并处于底物结合空间口袋。大幅度提高了Pel419表达量，并获得了Pel419关键结构信息。

以油茶近成熟种子为材料,根据油茶EST文库中已知的脂氢过氧化物裂解酶EST序列,利用3’RACE与5’RACE技术,克隆到脂氢过氧化物裂解酶的全长cDNA序列。该基因全长1648bp,,包含一个1476bp开放阅读框长,编码491个氨基酸,5’与3’非编码分别为52bp、121bp。预测该蛋白相对分子量为54.7779KDa,等电点为6.77,是个叶绿体转运肽,N端包含有22个疏水氨基酸残基组成的序列,不仅具有转运肽富含的丝氨酸,还含有大量转运肽中很少存在的脯氨酸。多序列比对发现油茶脂氢过氧化物裂解酶核苷酸序列与茶的相似性达到96%,因此将该基因命名coHPL。

采用基于EST的电子克隆方法,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的尿黑酸叶绿基转移酶基因(Homogentisate phytyltransferase,HPT)cDNA序列为信息探针,对大豆的EST数据库进行同源检索筛选,获得了1 777 bp长大豆HPT基因的cDNA序列(GenBank登录号为:AY956421),经RT-PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,表明与电子克隆序列一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,173～1 408 bp),推测编码411个氨基酸的蛋白。该蛋白与拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)、苜蓿(Medicago sativ...

【目的】克隆大白菜果胶甲酯酶基因,为进一步探讨果胶代谢在大白菜育性调控中的分子机制提供帮助。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株(msms)和不育株(Msms)花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异条带TDF-24,通过RACE技术扩增该基因的cDNA全长序列,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,利用荧光定量PCR技术分析基因时空表达模式。【结果】该基因编码大白菜果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11),被命名为BrPME1(GenBank登录号:HM185497)。BrPME1全长cDNA序列为1 290 bp,编码1个包...

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因ＰｓＰＬ１的功能，确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用，为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用ＲＡＣＥ技术扩增ＰｓＰＬ１基因全长，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ对ＰｓＰＬ１的表达特征进行分析，并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能，最后通过ＨＩＧｓ技术沉默ＰｓＰＬ１基因，确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到ＰｓＰＬ１基因全长，其ＯＲＦ长４７１ｂＰ，编码１５７个氨基酸；经预测ＰｓＰＬ１蛋白包含一个果胶酶保守结构域，Ｎ端含有一段由２１个氨基酸组成的信号肽序列；经酵母系统验证，确定ＰｓＰＬ１蛋白信号肽具有分泌功能；ｑＲＴ－ＰＣＲ分析发现，Ｐ．．．

采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增法(RACE),克隆了象耳豆根结线虫生长发育关键基因actin的全长cDNA序列(登录号:KF534787),并与NCBI核酸数据库进行序列比对,结果表明:序列全长1298 bp,包含一个全长1125 bp的开放阅读框ORF,编码375个氨基酸,起始密码子在82位,终止密码子在1207位,与已知的其它物种的actin具有高度的保守性,与马铃薯腐败线虫和松才线虫actin的同源性分别为99.20%和98.67%,与秀丽隐杆线虫、人类相似性分别达到98.67%和97.33%。系统发育分析表明,象耳豆根结线虫actin可能是β-actin,同时也发现了象耳豆根结...

2002-2005年,对以晋豆23为母本、灰布支为父本的大豆重组自交系Jinf F10群体的29个主要农艺性状和抗大豆孢囊线虫4号生理小种抗性进行了研究分析。结果表明:大豆重组自交系根系孢囊量与小区产量、单株粒重、粒长呈高度负相关,与单株质量、荚粒重呈显著负相关,与4粒荚数呈高度正相关,与粒宽、叶宽呈显著正相关。不同抗性的抗孢囊材料,相关性存在差异,高抗材料与株高、开花日数呈高度正相关;中抗材料与主茎节数和生育日数呈显著负相关,与单株粒重呈显著正相关;中感材料与29个主要农艺性状相关不显著;高感材料与百粒重、2粒荚长、小区产量、茸毛数呈高度正相关,与茎粗呈显著正相关。大豆重组自交系质量性状,黑...

目的测定和分析2013年同一生长季大豆和烟草上大豆孢囊线虫(Heterodera glycines,SCN)的群体动态和世代发生特点,探讨2种作物对大豆孢囊线虫的寄主适合性差异和温湿度等气象条件对线虫发生的可能影响。方法采取"Zig-Zag"取样法对同一地点2种作物上的大豆孢囊线虫每隔6—8 d同时取样,用淘洗-过筛法和贝曼漏斗法分离土壤中线虫,用次氯酸钠-酸性品红染色法对根组织中线虫染色,镜检并计数。统计作物生长季每旬100 g土壤和10 g根组织中各虫态的数量,即群体密度。结果在大豆和烟草土壤中,大豆孢囊线虫2龄幼虫均出现于4月7日至9月15日,最大群体密度均发生在7月下旬,之前分别有2个...

以拟南芥吡哆醛激酶基因(PK)的蛋白质序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为1 102 bp的大豆吡哆醛激酶基因的cDNA序列,经RT-PCR克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列一致(GenBank登录号为DQ006813)。该cDNA序列的开放阅读框(ORF)位于第119~1 045位,推测编码308个氨基酸。采用半定量RT-PCR方法研究了该基因的组织特异性表达情况和对强光逆境的反应,结果表明该基因在大豆根茎叶中都有表达,对强光逆境不敏感。将大豆PK基因编码的蛋白序列与马铃薯(Solanum tuberosum,AAY8518...

【目的】对南方根结线虫乳酸脱氢酶基因(mildh)进行克隆分析,并探索mildh沉默对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)病害的抑制作用。【方法】在前期研究中,利用生物信息学方法在线虫全基因组中预测了一些线虫RNA干扰(RNAi)表型基因。本研究以预测的线虫ldh设计特异引物克隆南方根结线虫中mildh。对克隆到的mildh序列进行了特征分析后,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术,将其导入番茄植株,并接种南方根结线虫,研究mildh基因沉默对根结线虫根结数量影响。【结果】克隆到的mildh包含1个完整的编码框序列,编码315个氨基酸。该基因与预测到的mildh核苷酸序...