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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张倩 廖玉才 陈方方 董璇 李和平
通过PCR克隆了大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA,分别构建了含manA基因的原核和真核生物表达载体。在大肠杆菌中经IPTG诱导表达的GST-PMI融合蛋白,经亲和层析纯化和PreScission蛋白酶酶切,SDS-PAGE分析证实PMI蛋白为42 ku。对转manA基因的拟南芥进行PCR分析表明,manA基因已稳定整合到拟南芥基因组中。氯酚红显色反应证实,整合到拟南芥基因组中的manA基因能表达具有6-磷酸甘露糖异构酶活性的PMI蛋白。这些结果说明,克隆的manA基因可在细菌和高等植物中高效表达。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨欣 梁爱华 罗晓丽 吴家和
甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi/manA)是当前植物转基因工程的重要选择标记基因,在生物安全上被认为是无害的。根据同源序列从大肠杆菌DH10B基因组中克隆出pmi基因。通过诱导原核表达获得PMI目的蛋白,对粗提和经过镍柱纯化的PMI蛋白进行Western分析和酶活反应鉴定。以上结果表明,PMI蛋白成功诱导,其分子量为46kDa,纯化过的PMI具有高的酶活性,能催化甘露糖-6-磷酸发生异构反应生成果糖-6-磷酸。同时利用pmi基因作为选择基因构建植物表达载体pCPMi,通过农杆菌介导法转化烟草获得转基因植株,PCR检测结果表明96个再生植株有72株为阳性。以上结果表明,克隆的pmi基因具有高...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张学文 田志坚 吴永尧 周双德 康冬丽
为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物.以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段.经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员.将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRSET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21DE3(pLysS),经过诱导获得了此酶的高效表达.
关键词：
β-甘露聚糖酶 基因克隆 表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蒋倩 王枫 侯喜林 马静 李梦瑶 熊爱生
以2个芹菜品种‘津南实芹’和‘美国西芹’为试材,采用RT-PCR技术分别获得6-磷酸甘露糖还原酶(M6PR)cDNA序列。序列分析表明:来源于2个芹菜品种的6-磷酸甘露糖还原酶基因核苷酸序列全长均为930 bp,编码309个氨基酸;预测其蛋白质相对分子质量为35×103,pI值为6.38。空间结构分析显示:M6PR蛋白由11个α-螺旋和13条β-延伸主链组成,中间形成1个疏水穴;催化四分体(Asp、Tyr、Lys和His)分布于疏水穴内部,具有催化活性。进化分析显示:芹菜M6PR与卷柏、小立碗藓、云杉等远古物种的醛-酮还原酶(AKR)相似性较高。实时定量PCR表达分析表明:M6PR基因主要在芹...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
闻雅男 王学英 夏润玺 王媛媛
为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶...
[期刊] 草业科学
[作者]
马春娟 杨宇泽 邹爱爱 孙康永杰 万雪瑞 王川 魏亚琴
为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌，本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板，首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因，然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达EG蛋白，最后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组内切酶的酶活力，分析其酶学性质。结果表明：成功构建表达载体pET-28a::eg，重组菌株E. coli BL21/pET-28a::eg在28℃用IPTG诱导14 h后纯化得到重组的EG蛋白，EG蛋白大小约为50 kDa，刚果红染色有明显水解圈。用DNS法测得EG的酶活为12.60 U·mL~(-1)，滤纸总酶活为3.53 U·mL~(-1)。重组酶在不同底物的反应中，羧甲基纤维素钠为底物的酶活力最高，脱脂棉最低。重组酶的最适温度为40℃，最适pH为7.0。在此条件下，Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、K~+、Mn~(2+)等离子均可对重组蛋白EG的酶活力具有促进作用，Zn~(2+)可促进但差异不显著，而Hg~(2+)、Cu~(2+)对EG的酶活力具有抑制作用。本研究构建的重组内切酶菌株可以高效水解纤维素，为内切酶的工业应用奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
熊帅 张军科 谌悦
【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李晶晶 赵德明 徐广贤 周向梅 尹晓敏
为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
潘风光 宋德群 任洪林 艾永兴 柳增善
地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α -淀粉酶(α -amylase)的优良菌株。在提取地衣芽孢杆菌基因组DNA基础上 ,通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的全长基因1539bp ,与pUCm -T载体连接转化入克隆菌DH5α中 ,经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌 ,再提取质粒与表达载体pET-28a( +)酶切后连接转化入宿主菌DE3中 ,其阳性重组子在37℃1.0mmol·L-1IPTG诱导下 ,α -淀粉酶的基因得到了较好的表达。表达产物经SDS -PAGE鉴定 ,确定表达蛋白的相对分子量为63000左右 ,与理论推导的分子量相一致。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
白俊杰 叶星 李新辉 简清 罗建仁
用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素 (GH)成熟肽基因序列 ,定向克隆至质粒pUC18。序列分析表明 ,克隆的猪GHcDNA长 5 73bp ,不含信号肽序列 ,并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV2 2 0 ,构建成重组猪GH基因表达载体pBVpGH7。SDS PAGE和薄层扫描分析表明 :经 42℃诱导 ,pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约 2 2 0 0 0的特异蛋白 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 .5 %。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
罗维 余兴龙 白霞 李润成 侯强红 尹恒
根据Z26520中fedF序列设计1对引物,从发病仔猪的腹泻粪便分离获得的大肠杆菌中扩增得到fedF基因,经纯化、连接、转化,将其成功克隆到pMD18-T中,所克隆fedF基因序列与GenBank中收录的其他fedF基因序列的同源性达97.8%～99.2%.另设计1对引物,利用基因工程方法将所克隆的fedF的编码序列亚克隆到表达载体pBV220中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达重组菌.测序结果表明,插入编码序列与预期序列一致.SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明,重组菌在诱导后可以表达特异性的相对分子质量为30 100的FedF蛋白.
关键词：
大肠杆菌 fedF基因 克隆 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李佼 余有本 周天山 肖瑶 柳洁 肖斌
【目的】对茶树GDP-甘露糖-3′,5′-异构酶(GDP-Mannose-3′,5′-epimerase,GME)基因cDNA全长进行克隆分析及原核表达。【方法】以茶树品种"乌牛早"叶片的cDNA为模板,用RT-PCR和RACE技术克隆GME,并对其进行生物信息学分析。利用pETiteTM N-His SUMO Vector构建GME原核表达载体pET-GME,在大肠杆菌HI-Control BL21(DE3)中进行原核诱导表达。采摘同一茶树嫩茎、芽、叶片以及不同品种茶树叶片样品,提取其RNA,反转录合成cDNA后,通过荧光定量PCR分析GME在不同茶树组织和品种中的表达谱。【结果】克隆获得了...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王江英 张宁 司怀军 吴家和
根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物,利用3',5'-RACE技术,从棉花叶片中克隆出GDP-甘露糖-3',5'-异构酶(GDP-mannose-3',5'-epimerase,GME)基因,命名为GhGME。基因全长1 467 bp,开放阅读框1 131 bp,编码376个氨基酸,分子量为42.39 6 kDa,等电点pI=6.291。利用荧光定量Real-time RT-PCR方法对棉花根、茎、叶和3种处理下该基因的表达特性进行分析,结果表明,GhGME在根、茎中高水平表达,在叶中表达量较低。在4℃低温和200 mmol/L NaCl处理下该基因表达上调,然而用100μmol/L ...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱春平 李燕 吴亚丽 常婧竹 刘琳 高文明 李新生
【目的】克隆和表达H3N2型猪流感病毒(SIV)A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的核蛋白(NP)基因,为制备NP抗体和SIV基因工程疫苗奠定基础。【方法】提取SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的RNA,用RT-PCR扩增NP基因,将其定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体,构建重组表达载体,并将其转化入大肠杆菌Rosetta中表达,用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,同时考察IPTG不同浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和不同诱导时间(2,4,6,8h)对重组NP蛋白表达量的影响。【结果】克...
[期刊] 华北农学报
[作者]
黄冬艳 杨兵 齐欣 陈小玲 徐福洲
根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a(+)载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。
关键词：
鸡贫血病毒 VP1基因 克隆 表达
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