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[期刊] 中国农业科学
[作者]
吕殿红 蒋红霞 曾振灵 陈杖榴
【目的】对大肠杆菌AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因进行原核表达,获得的表达产物AcrA、AcrB蛋白分别免疫兔,制备相应的抗体,建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【方法】扩增AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因片段,扩增片段分别与原核表达载体pET-41a(+)连接构建重组质粒,于BL21(DE3)中进行诱导表达。表达产物AcrA、AcrB纯化后分别免疫新西兰大白兔,获得抗AcrA、AcrB抗血清,并用Western blot方法对表达产物进行鉴定分析。纯化的AcrA、AcrB蛋白分别按不同的浓度包被酶标板,与不同稀释倍数的抗血清反应,通过ELISA检测确定最佳抗...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
崔保安 陈红英 张素梅 刘占通 金喜新 宋凌云
【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲...
关键词：
猪α干扰素 原核表达 抗病毒活性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈善真 李春玲 贾爱卿 王贵平
【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)外膜蛋白P5(outer-membrane protein P5,OMP5),建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
车勇良 陈如敬 江斌 王隆柏 魏宏 吴学敏 庄向生 周伦江
采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌(Hps)的寡肽结合蛋白(Opp A)基因,序列测定结果表明,扩增片段全长1654 bp.将扩增片段插入表达载体p GEX-6P-1中,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组融合蛋白大小约为87 ku,以纯化的重组蛋白Opp A作为抗原,建立Hps抗体的间接ELISA检测方法.通过试验确定最佳的反应条件为:抗原包被浓度为1.0μg·孔-1,于37℃包被1 h,待检血清的稀释度为1∶50,阳性判断标准(D450 nm)大于0.643.特异性和重复性试验结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和稳定性,可用于Hps抗体的检测.
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
王文棋 盖颖 陆海 蒋湘宁
为了实现DNA重组酶Cre在体外的应用,以pET-30a高效表达载体为基础构建了pTE30-Cre质粒.将此质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导的Cre基因的高效表达.对表达出的Cre重组酶蛋白进行镍离子鳌合法一步纯化,并以带有两个同向loxP位点的质粒为底物,对纯化出的Cre酶进行活性检测.该实验为Cre酶的体外应用奠定了基础.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张淑霞 贺秀媛 崔保安 王建华
鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL-p2X,构建重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达。通过pMALTM融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA法检测其生物活性。结果表明,表达的重组核蛋门纯化后出现2条带,相对分子质量分别约为92和82 ku,与Western blot出现的2条蛋白带一致;纯化的重组蛋白经裂解因子作用后,出现2条蛋白带,相对分子质量分别为45和35 ku,与...
关键词：
鸡传染性支气管炎病毒 N基因 免疫活性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
庄娜 陈雪影 岳磊 廖晓萍 刘雅红
【目的】检测分离自广东省散养型养殖场的动物源大肠杆菌中oqxAB基因及其它质粒介导喹诺酮类耐药基因(PMQR)的流行情况。【方法】采用PCR方法检测oqxA、oqxB、qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因;琼脂平板稀释法对PMQR阳性菌株进行18种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。【结果】qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr、oqxA、oqxB的检出率依次为10.49%、18.88%、31.47%、44.8%和48.9%,但未检测到qnrA、qnrC、qnrD和qepA。oqxA与oqxB的检出率较高,且oqxA与oqxB常常同时存在。多数菌株同时携带两个或两个以上的PMQR基...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
于寒颖 杨谦
不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序.该基因编码五功能的AROM蛋白.为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS),将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶(DHQS)和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E,并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109中表达.酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX...
关键词：
基因表达 核盘菌 arom基因 大肠杆菌
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘泽文 田永祥 袁芳艳 刘威 周丹娜 杨克礼
为建立大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断和定量检测方法,用纯化的大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原免疫家兔制备阳性血清,其琼扩效价分别达到1∶32、1∶32、1∶128;利用该阳性血清IgG致敏醛化的绵羊红细胞,确定了最适K88、K99、987P阳性血清IgG的质量浓度分别为40、160、80μg/mL。用该方法对同一批次的K88、K99和987P纤毛抗原进行3次检测,K88、K99和987P纤毛样品的RIHA效价均为1∶1 600、1∶1 600和1∶800。结果表明,该检测方
关键词：
仔猪 大肠杆菌 纤毛抗原 反向间接血凝
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张雪寒 张强 张碧成 汪伟 倪艳秀 温立斌 李彬 周俊明 何孔旺 周萍
本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ＥＬＩＳＡ技术，检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（ＳｈＩｇＡ ｔｏｘＩｇＥｎＩｃ ＥＳｃｈＥｒＩｃｈＩＡ ｃｏＬＩ，ＳｔＥｃ）的抗体水平。根据紧密素２７个亚型的ｎ端保守序列，体外表达３９０～５４３ ＡＡ片段制备包被抗原，通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验，建立检测ＳｔＥｃ的抗体的间接ＥＩＩＳＡ方法。经优化筛选的间接ＥＬＩＳＡ最佳反应条件：抗原包被浓度３ ｎｇ／孔，待检血清稀释比例１∶２００，ｈｒＰ－兔抗羊Ｉｇ ｇ、ｈｒＰ－兔抗牛Ｉｇ ｇ的工作浓度均为１∶１５０００，５％脱脂奶封闭Ｌ ｈ，底物作用时间１０ｍＩｎ，用于牛、羊疫苗抗体检测或者ＳｔＥｃ大肠杆菌．．．
关键词：
致病性大肠杆菌 紧密素 间接ELISA
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
闻雅男 王学英 夏润玺 王媛媛
为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
曹晓风 赵武玲 吴玮 阎隆飞
高等植物细胞内含有肌动蛋白 ,但含量较低 ,难于提取及进行进一步研究。我们用 PCR的方法扩增肌动蛋白 c DNA,并克隆到表达质粒 p Trp His,然后转化大肠杆菌 DH5α;在 IPTG诱导下 ,肌动蛋白表达在包涵体中 ,在没有 IPTG诱导时 ,肌动蛋白表达在胞液中
关键词：
肌动蛋白 基因表达 包涵体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
熊帅 张军科 谌悦
【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张守涛 史婧 李楠 郭蔼光
根据蛇毒纤溶酶(A lfim eprase,ALF)氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,设计了14条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法人工合成了ALF基因编码区。通过克隆使其分别连接在融合标签N usA,T h ioredox-in,Skp,H is T ag和信号肽pe lB的C端,构建成了多种ALF表达载体p43-A lf,p25-A lf,p32-A lf,p15-A lf和pSkp-A lf,转化大肠杆菌后进行了诱导表达,并对表达产物进行了SDD-PAGE分析。实验结果表明,合成的ALF基因长度为603 bp;构建的表达载体在大肠杆菌中均获得了很好的表达,其中pSkp-A lf表达量最高...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
白俊杰 马进 简清 李新辉 罗建仁 林文辉 张红军
采用聚合酶链反应 (PCR)技术对鲤和鲑生长激素cDNA的 5’端和 3’端进行定向改造。将改造后的5种基因分别克隆到大肠杆菌表达质粒 pBV2 2 0进行原核表达 ,以研究鱼生长激素基因在大肠杆菌中的表达水平。实验结果表明 :(1)核糖核蛋白体结合位点 (SD)与起始密码子AUG之间的距离对鱼生长激素的表达水平有影响 ;(2 )鲑生长激素基因的终止密码子UAG可能不会有效终止该基因在大肠杆菌中翻译的进行而造成部分通读 ,加入大肠杆菌强终止码UAA可避免通读和产生超长蛋白 ;(3)对鲤和鲑生长激素cDNA的 5’端和 3’端进行相同的修饰 ,但两者生长激素的表达量却有很大差异 ,说明基因的密码...
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