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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张优优 徐坤 王亮亮 张婷婷 辛颖 任充华 闫强 张智英
【目的】扩增大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC,制备orfA和orfC重组腺病毒,并感染Hela229和SPC-A-1细胞,以检测orfA和orfC对肿瘤细胞的影响。【方法】从pWDSV全长表达载体中扩增WDSV辅助基因orfA和orfC,构建orfA和orfC基因的重组腺病毒载体以及对照空载体,采用脂质体介导法转染HEK293细胞进行包装和扩增,用绿色荧光蛋白法测定重组腺病毒的滴度;将重组腺病毒转染肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1,采用Weastern Blot方法检测基因orfA和orfC的表达情况,并用MTT法检测其对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李铎 徐坤 王亮亮 周罡 麻丽霞 张智英
【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSVorfA和orfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白后,采用皮下多点注射结合耳静脉加强免疫的方法免疫新西兰白兔,制备抗orfA和抗orfC的多克隆抗体,用Western blot法检测抗体的特异性。用制备的多克隆抗体检测orfA和orfC融合蛋白在酵母和HeLa299、SPC-A-1肿瘤细胞中的表达。【结果】PCR扩增获得了WDSVorfA和orf...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张琼 姜碧杰 成功 刘扬 昝林森
【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶...
关键词：
ADIG 腺病毒 同源重组 秦川牛
[期刊] 中国农业科学
[作者]
魏胜娟 昝林森 王洪宝 成功 季舒涵 王虹 付常振 姜碧杰
【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4序列与GenBank收录的一...
[期刊] 华北农学报
[作者]
吕翠 马小明 尹燕博 单虎
以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物。应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致。本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探...
关键词：
地高辛标记的核酸探针 猪流感病毒 检测
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙永科 杨玉艾 王养会 李普华 张彦明
用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
贾立军 张守发
【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒;将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1感受态细胞,构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒;PacI酶切线性化后,脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1,应用PCR和...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
展小过 乔传玲 杨焕良 陈艳 孔维 辛晓光 陈化兰
【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
蔡伟光 习欠云 肖敏 关立增 孟繁明 束刚 朱晓彤 江青艳 吴珍芳 张永亮
【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为:100μL慢病毒原液(5×105cfu)与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子(109个/mL)给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件(100μL慢病毒原液(...
关键词：
慢病毒 精子介导转基因 转基因猪
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨玉艾 孙永科 华进联 窦忠英
为了探讨心肌肌动蛋白(α-actin)基因启动子的心肌组织特异性及其表达活性,构建了心肌组织靶向性表达的基因载体,应用PCR从pEGFP-N1-α-actin-P质粒中克隆出α-actin启动子片段,将其插入到切除CMV启动子的腺病毒穿梭载体pAdTrack中,构建出pAdTrack-actin重组穿梭载体,经酶切和测序鉴定正确后用PmeI线性化,与含有腺病毒骨架DNA的pAdEasy-1质粒在BJ5183大肠杆菌细胞中同源重组成新的重组体pAd-easy-actin,抽提重组体DNA,经PacI酶切回收后以脂质体法转染人胚肾细胞株HEK293,包装出完整腺病毒pAd-actin进行PCR检测...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李守湖 范玉锋 高欣 李宝玉 吴鹏程 胡永浩 柳纪省
【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒（IHNV）G基因，构建其重组腺病毒载体，为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因，将G基因插入到腺病毒穿梭载体中，再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒质粒，通过PCR扩增及Sal Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装，获得带有目的基因的重组腺病毒，通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒，用Western-blot法检测糖蛋白的表
关键词：
传染性造血器官坏死症 G基因 腺病毒载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
吉祥 宋志成 韦晓玲 杨煜 隋炯明 郭宝太
为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测，构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白，用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合，与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中，稀释度为1∶3 200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应；在DAS-ELISA反应中，稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明，制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测，也可用于DAS-ELISA检测。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黄凯 林亚秋 朱江江 马洁琼 王永
【目的】为利用超表达手段进一步研究成纤维细胞生长因子1(FGF1)基因对山羊肌内前体脂肪细胞分化过程的影响。【方法】本试验通过构建p Ad Track-CMV-FGF1穿梭质粒,转入含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,获得腺病毒超表达载体pAdEasy-FGF1,经Pac I酶切鉴定后转染293A细胞进行病毒的包装与扩繁,最后用包装的pAdEasy-FGF1感染山羊肌内前体脂肪细胞,检测感染前后FGF1的表达变化。【结果】成功构建了腺病毒超表达载体p AdEasyFGF1,并在293A细胞中成功包装,其感染山羊肌内前体脂肪细胞能显著上调FGF1 mRNA的表达水平。【结论】说明FGF1基因可以通过感染重组腺病毒表达载体pAdEasy-FGF1在山羊肌内前体脂肪细胞中实现超表达。
关键词：
山羊 成纤维细胞生长因子1 腺病毒
[期刊] 中国农业科学
[作者]
付常振 昝林森 王虹 成功 王洪宝 李耀坤 姜碧杰 高建斌 杨宁
【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区(coding sequence,CDS)序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并...
关键词：
牛 SREBP1 shRNA 重组腺病毒
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋志成 费新敏 杨煜 乔利仙 王晶珊 李广存 郭宝太
利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA
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