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[期刊] 淡水渔业
[作者]
李胜杰 白俊杰 刘碧莲 叶星 于凌云 全迎春
将大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗菌肽hepcidin cDNA定向插入真核表达载体pPICZαA,通过SacI酶切线性化重组表达质粒pPICZαA-hepcidin,电转化毕赤酵母P.pastoris GS115,PCR扩增筛选,甲醇诱导表达等进行了hepcidin真核表达工程菌株的构建及诱导表达。结果显示:hepcidin cDNA成功插入表达载体pPICZαA,并整合到酵母基因组中;经甲醇诱导,RT-PCR检测显示hepcidin cDNA在酵母细胞中成功转录。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王小玉 林华 郭万柱 徐志文 王印 朱玲
为了构建含有EGFP的猪ProTα基因的真核表达载体,用RT-PCR从猪肾脏中扩增ProTα基因,连接到T载体,测序鉴定后,连接到pEGFP-N3真核表达载体,构建真核表达载体pEGFP-ProTα。通过脂质体法转染Vero细胞,进行荧光检测。结果表明,构建的pEGFP-ProTα真核表达质粒,转染Vero细胞后,经荧光观察EGFP-ProTα融合蛋白有向细胞核聚集的现象。结论:本研究成功构建了真核表达载体pEGFP-ProTα,并在Vero细胞中表达,为研究猪ProTα的功能奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
董建宝 谢芝勋 孙建华 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基
设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。
关键词：
鸡γ-干扰素 绿色荧光 真核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
孙星虹 孙晓凤 孙雷雷 李兰
为研究小鼠Dazl基因的功能及探究Dazl基因过表达在干细胞向生殖细胞分化过程中的作用,采用RTPCR方法,从13.5 dpc雌性胎鼠卵巢中克隆出Dazl基因的全部编码区,测序正确后利用限制性内切酶将其连接到真核表达载体pc DNA3.1上。线性化后对小鼠成纤维细胞进行转染,qRT-PCR及Western Blot技术显示外源基因Dazl已经成功转染并表达。为研究Dazl基因的功能及干细胞向生殖细胞的诱导分化奠定了基础。
关键词：
Dazl基因 真核表达载体 转染
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳乐军 梁卓玲 黄真池 沙月娥 曾富华
【目的】构建aiiA基因的原核表达载体，并进行诱导表达，检测aiiA蛋白的抗病性，为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】 从pMD-TM-19-T Vector＋aiiA质粒中酶切获得aiiA基因，将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1＋aiiA，经双酶切及测序鉴定后，进行诱导表达，并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明，重组原核表达载体pGEX-4T-1＋aiiA构建成功。表达条件优化结果表明，在25 ℃下用0.2 mmol/L IPTG诱导9 h，aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明，...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳乐军 梁卓玲 黄真池 沙月娥 曾富华
【目的】构建aiiA基因的原核表达载体,并进行诱导表达,检测aiiA蛋白的抗病性,为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】从pMDTM19-T Vector+aiiA质粒中酶切获得aiiA基因,将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA,经双酶切及测序鉴定后,进行诱导表达,并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明,重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA构建成功。表达条件优化结果表明,在25℃下用0.2mmol/L IPTG诱导9h,aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明,其能够降解细...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李军 吕长荣 窦琳 窦忠英
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化TGⅠ大肠杆菌,筛选阳性克隆,其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘峰 曹雅琴 张学文 李良勇 邓晶 郭清泉
通过RT-PCR获得UDPGDH cDNA序列,经酶切、连接,以pET-32a为原核表达载体,构建成pET-32a-UDPGDH重组表达载体.经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化表达受体菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后表达出1个约53 000的蛋白,与推测的UDPGDH编码产物的大小一致.凝胶成像分析表明,最高表达量可占菌体总蛋白的47.1%,表明UDPGDH重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李玲玲 张伟 杜蕊 宋玲珍 柴学军 胡新德 陈树林 赵善廷
【目的】构建能够在神经系统中高效表达的小鼠cofilin-1野生型(Cfl1-wt)、活化型(Cfl1-S3A)、失活型(Cfl1-S3D)3种真核表达载体,并研究其在鸡胚脊髓神经元中的表达情况,为进一步探讨cofilin-1在大脑发育过程中对神经元迁移的影响奠定基础。【方法】从成年小鼠大脑组织中提取RNA,经反转录获得cDNA样本,RT-PCR扩增小鼠cofilin-1基因的CDS区,经引物设计引入点突变,扩增了野生型、活化型及失活型的cofilin-1基因片段,克隆入pCAG-MCS-myc真核表达载体中。经双酶切和测序鉴定后,转染CHO细胞,通过半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测其在细...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏凤艳 宗春苗 王卓聪 丁庆东 王全凯
为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。
关键词：
水貂 犬瘟热病毒 F基因 真核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴景龙 隋丹丹 张冬辉 周智敏 李昊 郑雪莉 韩崇选
【目的】利用基因重组技术将草兔卵透明带3基因(ZP3)构建到真核表达载体上,并在RK-13细胞中表达ZP3蛋白,为后期的免疫不育研究提供方便。【方法】提取草兔卵巢总RNA,采用RT-PCR方法克隆ZP3基因,将其与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-ZP3表达载体,并将载体转入RK-13细胞中进行ZP3表达。利用倒置荧光显微镜、RT-PCR和Western Bolt方法对重组ZP3蛋白表达情况进行观测。【结果】RT-PCR获得长为1 260bp的草兔ZP3基因;成功构建pEGFP-N1-ZP3重组质粒,将其转染RK-13细胞后表达出73ku的重组ZP3蛋白,RT-PCR验证...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杜学海 曹蕊 萧鹏 李伯江 吴望军 刘红林
为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王青 张彦明 王选年 张改平 胡建和 杨苏珍 赵东 邢广旭 徐彦召 赵光辉 段艳华
应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。
关键词：
新城疫病毒 F基因 真核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
汤展毅 严云勤 高学军 陆黎敏 朱丹丹 冀志庚
【目的】构建牛myf6基因真核表达载体,并观察myf6真核表达载体转染鲁西黄牛成肌细胞后基因的表达和细胞形态的变化。【方法】在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株。利用Western印记、Real-time PCR技术检测成肌细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量。【结果】与对照组相比,转染质粒的成肌细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高(P<0.01),肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量提高(P<0.01)。细胞...
关键词：
牛myf6 稳定转染 成肌细胞
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
董章勇 秦世雯 王振中
【目的】构建香蕉枯萎病菌1号小种(FOC1)和4号小种(FOC4)果胶裂解酶(Pectate lyases,PL)基因的真核表达载体,并进行诱导表达,为进一步研究PL在病原菌致病过程中的作用奠定基础。【方法】将质粒pMD18-pl-foc1、pMD18-pl-foc4和真核表达穿梭载体pPICZαA进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应,回收目的片段连接,转化至DH5α进行筛选扩繁,对菌落进行PCR鉴定后抽提质粒进行PCR和EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定。将阳性载体线性化后电击转化毕赤酵母SMD1168感受态细胞,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析。【结果】成功构建了FOC1和...
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