为了分离克隆与植物互作的大丽轮枝菌致病相关蛋白基因,利用SMART技术构建了大丽轮枝菌酵母双杂交c DNA文库。结果表明,构建的文库滴度为5.2×107cfu/m L,库容为3.9×107cfu;文库c DNA插入片段长度主要分布在0.5~2.0 kb,平均为1 kb;文库重组率为96%。表明文库质量较好,为筛选与植物互作的大丽轮枝菌致病蛋白基因奠定了基础。

为了研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)免疫及抗病相关蛋白和大分子物质的功能及相互作用机制,构建了牙鲆酵母双杂交cDNA文库。原始文库滴度为1.6×106 CFU/mL,随机选取单克隆菌落进行PCR扩增,根据PCR扩增结果表明插入片段大部分大于500 bp,平均长度约为1.5 kb,随机调取了115个EST进行了序列测定。扩增后放大文库库容约为1.8×1012 CFU。转化酵母后,文库转化效率为3.6×105CFU/μg,文库库容为5.4×106CFU。牙鲆酵母双杂交文库的构建成功为鲆蝶类免疫机理的研究,尤其是信号分子通路研究提供有效的工具。

为筛选与羊口疮病毒(OrfV)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，构建了羔羊睾丸(LT)细胞酵母双杂交cDNA文库.采用Trizol法提取LT细胞总RNA,运用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,再经同源重组法将pGADT7-Rec载体与cDNA共转化至Y187酵母菌株，利用营养缺陷型选择性培养基(SD/-Leu)筛选阳性克隆，并鉴定文库质量.结果显示：LT细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功，其文库滴度为2.33×10~8 CFU·mL~(-1),文库容量达3.5×10~9 CFU;随机挑选34个单克隆进行PCR检测，插入片段大小为250～2 000 bp,平均大小约为1 000 bp,文库重组率达100%.由此表明，本文库达到高质量文库条件，可作为研究OrfV与宿主细胞间互作机制的生物材料.

【目的】近年来稻曲病日益严重，但目前对稻曲病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ）与水稻相互作用机制仍不清楚。论文旨在利用水稻感病颖花材料构建酵母双杂交文库并筛选稻曲病菌效应因子互作蛋白，为解析稻曲病菌侵染水稻机制提供理论基础。【方法】以感病水稻ＣｈＵａｎｎｏｎｇ ｈ２ｓ为试验材料，在水稻破口前５—７ ｄ左右，从水稻穗中上部接种ＰｓＢ摇培７ ｄ的稻曲病菌荧光标记菌株Ｐ４，接种１３ ｄ后取颖花进行激光共聚焦观察，收集感病颖花。提取感病颖花总ｒｎａ，使用含有ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）的接头引物反转录Ｃｄｎａ第一链，并ＰＣｒ扩增ｄｓ Ｃｄｎａ，通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收ｄｓ Ｃｄｎａ片段，与载体Ｐ．．．

为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350～2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。

[目的]构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库,筛选与细胞色素C还原酶铁硫蛋白(BcRISP1)互作的蛋白。[方法]从不结球白菜Pol胞质雄性不育花中提取总RNA,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。采用SMART建库技术构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花全长cDNA文库。利用BcRISP1基因的开放阅读框,构建诱饵表达载体pGBK T-7-BcRISP1转化AH109酵母菌,根据酵母双杂交技术筛选出与BcRISP1互作的片段,并进行质粒共转化验证。[结果]经检测,文库的转化率为每μg p GADT7-Rec 1.80×106转化子,文库滴度为1.21×10...

为深入研究鲤疱疹病毒Ⅱ型CyHV-2与宿主细胞相互作用机制,以鲫脑组织细胞系(Gibel carp brain,GiCB)总RNA为模板,反转录合成cDNA,扩增获得双链cDNA,与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187,构建了GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库。以CyHV-2 ORF25编码蛋白为诱饵,与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交,筛选与其互作的GiCB细胞受体。结果显示:GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库转化效率为1.03×10~6 CFU/μg,滴度为1.24×10~6 CFU/mL,PCR扩增结果表明文库中插入片段的大小在1.5 kb左右。将表达CyHV-2 ORF25编码蛋白的诱饵菌与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交后,筛选得到与ORF25编码蛋白相互作用蛋白的阳性克隆,为进一步研究CyHV-2的感染机制奠定了前期基础。

【目的】芍药具有极佳的观赏价值，但其种子的双重休眠难以解除，严重阻碍芍药的育种进程。本研究利用gateway技术构建芍药种子休眠解除关键时期的酵母杂交cDNA文库，可用于筛选调控芍药种子休眠解除相关基因的转录因子及互作蛋白。本文库的构建可为丰富芍药种子休眠调控研究提供科学支撑，能为芍药栽培育种和野生资源保护及利用奠定分子理论基础。【方法】本研究以休眠解除过程中5个关键时期的芍药种子为试验材料，进行总RNA的提取和m RNA的分离，使用gateway方法构建cDNA初级文库，再通过LR重组，将初级文库重组到pGADT7-DEST次级文库载体上，构建出次级文库，最后经过酵母转化试验，将次级文库质粒转化到酵母Y187感受态细胞中，构建出芍药种子休眠解除过程的酵母文库。【结果】经鉴定，cDNA初级文库库容量为1.28×107 CFU，平均插入片段长度在1 000 bp以上，重组率为100%;cDNA次级文库库容量为1.12×107 CFU，平均插入片段长度在1 000 bp以上，重组率为100%；酵母文库滴度为7.0×107 CFU/mL，平均插入片段长度在1 000 bp以上，重组率为96%。23个阳性克隆测序结果经NCBI比对后，按照功能将20个已知蛋白序列划分为8类，其中7个序列已被报道参与种子的休眠与萌发。【结论】芍药种子休眠解除过程的酵母杂交cDNA文库构建的质量较高，具有较完整的基因信息，符合酵母文库筛选试验所需的标准，为构建芍药种子休眠解除过程的分子调控网络提供基础。

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白，深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作；最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×10~6和3.2×10~6 CFU·mL~(-1),平均插入片段大小在1 200 bp以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白，其中有2个MADS-box转录因子，3个E3泛素连接酶，2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达，而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白，并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1之间存在明显的互作关系。

[目的]从番木瓜4个不同成熟期果实的转录组中筛选并克隆得到1个转录因子CpMYB114L,构建番木瓜果实的cDNA文库,筛选与CpMYB114L互作的蛋白,探究CpMYB114L参与调控果实成熟的分子机理。[方法]以番木瓜‘GZBG’品种的果实为材料,设计特异引物,克隆CpMYB114L CDS区,利用生物信息学软件分析该基因序列及其编码的蛋白序列。提取番木瓜不同成熟期果实的总RNA,利用all-direct法建立酵母双杂交cDNA文库。构建pGBKT7-CpMYB114L诱饵载体,对其自激活检测后,通过共转化从文库中筛选CpMYB114L互作蛋白。通过在NCBI网站上进行序列比对,明确互作蛋白的功能分类,最后对各类蛋白基因在番木瓜不同成熟期果实中的表达进行分析。[结果]CpMYB114L基因的CDS序列编码227个氨基酸,预测其相对分子质量为26 304.3,理论等电点为6.23,亲水性总平均值为-0.893。CpMYB114L蛋白序列与甜樱桃(PaWERL)、蒺藜苜蓿(MtMYB1)、黧豆(MpMYB113)、大豆(GmMYB1)和苹果(MdMYB308L)的同源性较近。cDNA文库总库容为1.15×10~7 CFU,重组率100%,插入片段长度为750～2 000 bp。诱饵载体pGBKT7-CpMYB114L不存在自激活。从酵母双杂交文库中筛选到30个初始阳性克隆,经回转验证后最终获得26个与CpMYB114L互作的蛋白,共分为4类,包括乙烯响应受体1(CpERS1)、酰基辅酶A硫酯酶13(CpAcots13)、热休克蛋白42(CpHSP42)和叶绿体转运子159 (CpTOC159)。在果实成熟过程中,CpERS1和CpHSP42表达量先上升后下降,CpAcots13表达量持续上升,CpTOC159表达量剧增后趋于平稳。[结论]推测CpMYB114L与CpERS1蛋白互作参与番木瓜果实成熟的调控。

[目的]本文旨在使用“Mate＆Plate”技术构建簇毛麦受白粉菌诱导的酵母双杂交文库，鉴定正向调节小麦白粉病抗性的簇毛麦E3泛素连接酶蛋白CMPG1-V的互作蛋白，为解析其抗病性机制奠定基础。[方法]提取白粉菌诱导前及诱导后1、2、4、6、12、24和48 h的簇毛麦叶片总RNA，利用SMART技术分离纯化mRNA，合成ds cDNA，将ds cDNA和pGADT7-Rec载体共同转入酵母菌株Y187，构建簇毛麦酵母双杂交文库，明确文库插入片段大小和滴度。以CMPG1-V为诱饵筛库，并对部分互作蛋白进行了回补验证，利用BiFC方法验证CMPG1-V与筛选到的一个互作蛋白CMIN6（MYB25-V）的体内互作。[结果]成功构建了受白粉菌诱导的簇毛麦叶片酵母双杂交文库，文库滴度为9.5×10~(7 )CFU·mL~(-1)，插入片段长度在250～2 000 bp之间，重组率为100%。以CMPG1-V为诱饵筛选文库，获得79个互作蛋白，挑选其中10个互作蛋白进行回补验证。通过BiFC实验验证了CMPG1-V与MYB25-V的体内互作。MYB25-V及其在小麦中的同源基因TaMYB25受白粉菌诱导后均上调表达，推测MYB25-V可能参与调控小麦白粉病抗性。[结论]本研究成功构建了白粉菌诱导的簇毛麦酵母双杂交文库，为鉴定CMPG1-V的互作蛋白并解析其抗病性机制奠定了基础。

【目的】VlTFL1A是葡萄3个TFL基因之一,该基因在葡萄花序形成过程中发挥重要作用。筛选VlTFL1A启动子上游的调控因子,为研究该基因在调控葡萄成花中的机理奠定基础。【方法】由VlTFL1A的启动子构建诱饵融合载体,转化酵母细胞构建诱饵菌株。运用SMART技术构建葡萄酵母单杂交c DNA文库,再共转化诱饵菌株,筛选VlTFL1A启动子上游的调控因子。【结果】筛选出大于500 bp的9个阳性克隆,经测序和Blast同源性分析,作用在VlTFL1A启动子上游的调控因子分别为:信号识别受体亚基、钙调蛋白相关蛋白、转酮醇酶、木葡聚糖糖基转移酶、F-box蛋白、冠毒素不敏感基因1(COI1)、UV-B诱导蛋白、重金属相关的异戊二烯蛋白39等8个蛋白和一个未知功能的蛋白。【结论】筛选出的作用在VlTFL1A启动子上游的9个调控因子在葡萄花序形成过程中的功能尚未见报道,为进一步研究VlTFL1A基因的表达调控机制提供了候选蛋白。

【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素－神经氨酸酶（ＨＮ）蛋白线性中和表位区的诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ，为筛选靶向新城疫病毒ＨＮ蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成ＨＮ蛋白的线性中和表位区ＨＮ－Ｎｅｕ，将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体ｐＧＢＫＴ７中，构建诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ，经酶切鉴定和测序验证正确后，将ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ转化酵母菌Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ，检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了ＨＮ－Ｎｅｕ，构建的ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ在酵母细胞Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅ．．．

以人胎儿脑cDNA文库为模板克隆了钠钾泵β2亚基C末端编码区(N KAβ2ct),构建了表达载体pGBKT 7-NKAβ2ct,并对其进行了表达,对表达产物进行了检测。结果表明,N KAβ2ct长690 bp,pGBKT 7-NKAβ2ct酵母表达载体构建成功,在酵母中表达良好,可用于后续的酵母双杂交文库筛选工作。

ＳＫＰ２Ａ是调控细胞周期转录因子降解的Ｆ－ｂｏｘ蛋白。为研究该蛋白在小麦－叶锈菌互作过程的作用，首先克隆获得中国春小麦ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ全长序列，然后将其与ＰＧｂＫＴ７载体连接，转入酵母Ｙ１８７感受态细胞中，构建酵母诱饵表达载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明，ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ编码区序列长度为１ １４６ ｂＰ，其ｏＲＦ区编码一条由３８２个氨基酸组成的多肽。在ｏＲＦ区两侧连接酶切位点（ＥｃｏＲⅠ和ｂＡｍ ＨⅠ），并将其与载体ＰＧｂＫＴ７连接，成功构建了包含目的基因的诱饵载体ＰＧｂＫＴ７－ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ，且含重组诱饵质粒的酵母菌株在ＳＤ／－ＴＲＰ营养缺陷平板上生长良好，其．．．