【目的】建立适合于大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病性相关突变体的快速筛选体系,为突变库中与致病性相关突变体的系统筛选和鉴定提供技术支撑。【方法】棉花幼苗接种于5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107和5.0×108孢子/m L的孢子悬浮液30 min,通过病情指数调查明确引起棉花黄萎病发生的病原菌浓度范围;对培养于培养瓶的大丽轮枝菌分别加入15、25、35和45 m L的灭菌水,利用血球计数板检测洗脱的孢子浓度,明确不同体积灭菌水对洗脱孢子悬浮液浓度的影响;以保存于96孔板的突变体为单位,在培养皿上进行单孢分离并挑取单个孢子于培养瓶中扩繁培养,培...

采用转座子Tn5插入突变技术,共获得5 261个接合子。通过马铃薯软腐快速筛选和PCR检测验证,获得267个使马铃薯软腐能力丧失或下降的Tn5插入突变体,并测定其在水稻上的致病力和烟草上的过敏性坏死反应(HR)。结果表明:在267个突变体菌株中,对水稻无致病力的有71个,其中在烟草上无HR反应的有59个,产生HR反应的有12个;对水稻致病力下降的有68个,其余突变体菌株对水稻致病力与野生菌株差异不明显。另外,267个突变体菌株中有146个无HR反应,其中有90个对水稻无致病力或者致病力下降。致病力的分析结果表明,获得的突变体是由Tn5插入Dickeya zeae染色体上不同的致病相关基因位点导...

【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50μg·mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌...

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性...

Tri12是镰孢菌Fusarium编码单端孢霉烯族毒素(trichothecenes,以下简称“单族毒素”)输出泵的基因,而产毒基因Tri5编码的单端孢霉二烯合酶催化毒素生物合成中的第一步反应。以禾谷镰孢FusariumgraminearumSchw.野生型菌株NRRL29169为亲本,获得Tri12敲除的转化子MT12。与NRRL29169相比,MT12在PDA培养基上生长慢,生长量小(P<0.01),大分生孢子较长。致病力测定结果显示,NRRL29169致病力最强,所致病害可以自接种点向上下扩展至其他小穗,而MT12的致病力极弱。我们由此推测,Tri12的敲除导致病菌产生的毒素不能被泵出体...

为获得灰葡萄孢的致病相关基因并研究其基因功能,筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库,获得了一株致病力增强的突变体BCt98。利用PCR和Southern Blotting技术,对突变体BCt98进行鉴定。利用TAIL-PCR技术结合生物信息学方法,确定了突变体BCt98中T-DNA插入位点位于BC1G_07014.1基因的第3个外显子上。利用RT-PCR技术,确定了突变体BCt98的突变基因为BC1G_07014.1。突变体BCt98生长速度较快,菌落颜色较浅,菌丝较为致密,不产生分生孢子和菌核,且胞壁降解酶(PMG、PG和Cx)及毒素活性较野生型明显增强。表明BC1G_07014.1基因在灰...

用草酸毒素作筛选剂处理油菜愈伤组织，获得耐毒素的突变体，分化培养后得到小量再生植株。经用毒素处理离体叶片，油菜菌核病菌菌丝体接种离体叶片和田间植株及田间病圃测定几种方法鉴定显示，所获再生植株与原品系（２２４２）相比较，均不同程度提高了对菌核病的抗性，其Ｆ１代材料保持了抗性，Ｆ２代材料抗性有一定的分化，但大部分的仍保持了抗性，其中有Ｓ１１、Ｓ２１、Ｓ２３、Ｓ２４、Ｓ２５、Ｓ２６几个材料具有较明显的抗性，可用作抗源和进一步选育抗病良种。

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL~(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL~(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。

【目的】白粉病是危害黄瓜产量、品质的最严重的病害之一,抗白粉病材料的发掘与研究,可以实现从根本上解决病害问题。对获得的‘长春密刺’突变体材料进行分析,旨在筛选出黄瓜抗白粉病突变体材料,丰富育种群体。【方法】对400份‘长春密刺’突变体材料进行苗期接种白粉病菌试验,通过叶片病斑观察结合病情指数分析,初步筛选出抗病材料,将筛选出的抗病材料在大田环境下自然发病进一步观察表型。对初步筛选出的抗病材料进行苗期生理鉴定,测定并分析超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性以及叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、可溶性蛋白含量等生理指标,通过田间自然发病进一步筛选抗病材料,并测定其蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度、净光合速率等光合作用指标及乙烯、茉莉酸、水杨酸激素含量,并通过荧光定量PCR分析叶片中乙烯、茉莉酸、水杨酸、木质素、病程相关蛋白等防御信号途径中相关基因的表达。【结果】与感病材料相比,抗病材料的表面菌斑少,净光合速率、气孔导度都优于对照‘长春密刺’,胞间CO2浓度低于‘长春密刺’。在防御激素方面,抗病材料的乙烯、茉莉酸、水杨酸含量同样优于感病材料,而在成熟期叶片的防御信号途径相关基因表达上,抗病材料的表达高于感病材料。通过苗期接种白粉病菌和田间自然发病综合筛选出了两份抗白粉病突变体材料:Mu-86-2、Mu-58-9。【结论】通过对突变体库的筛选可以获得抗白粉病新材料,这些材料的获得对黄瓜抗白粉病的遗传研究和新品种培育具有重要价值。

利用SDS -PAGE技术 ,从河北省小麦地方品种及国内外小麦育成种 12 70份中 ,发现Wx B1突变体 6 3份 ,Wx D1突变体 4份 ,Wx E 2份。红蘖麦和白芒白等品种的发现 ,丰富了品质育种的亲本 ;长穗偃麦草的蜡质基因与小麦蜡质基因不同 ,可以进行更深入的分子水平研究。研究表明 ,地方品种和育成种具有相似的突变规律 ;国外优良品质材料含有较高的Wx B1突变频率 ;国内以源自北京、山西、陕西、云南的材料突变频率最高 ;河北、河南、山东、江苏等省份突变频率居中 ;而四川、天津、黑龙江和安徽等省份的样本量太小 ,突变频率也最低。该频率分布规律为今后育成种筛选的重点提供了帮助。

【目的】筛选大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)糖代谢相关基因,证实其与大丽轮枝菌的生长发育和致病性相关,为防治由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病提供理论基础。【方法】利用寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)技术对大丽轮枝菌糖代谢相关基因进行筛选。将单个或多个含靶标基因的病毒载体注射本氏烟草瞬时表达基因,7—10 d后八氢番茄红素脱氢酶PDS会出现明显的烟草白化症状,蘸根法接种大丽轮枝菌V.d991,对应的大丽轮枝菌靶标基因会被干扰,接菌14 d后,观察转基因烟草表型,统计烟草病情指数,同时利用荧光定量PCR技术检测转基因烟草中大丽...

比较小麦耐盐突变体近等基因系的钾离子含量及其与SOD活性的相关性分析,结果表明:耐盐性不同的近等基因系之间钾离子含量存在着显著差异,耐盐性强的RH8706-49含钾量最高;分别为耐盐性差的H8706-34、H8706-58的3.572倍和3.167倍。小麦功能叶片的SOD活性与钾含量呈极显著线性正相关。进而表明,小麦耐盐性强弱与旗叶叶片含钾量的多少在一定范围内呈正相关,钾可能参与了SOD的活性调节。

以茄子黄萎病菌毒素为选择剂,结合组织培养技术,离体筛选茄子抗黄萎病突变体,开拓一条体细胞抗病育种的新途径。结果表明,以茎段为外植体,在MS+IAA 1 mg/kg+NAA 1 mg/kg+KT 0.2 mg/kg培养基上愈伤组织诱导率最高,下胚轴次之,子叶最差;15%的毒素浓度(v/v)可以作为突变体的筛选压力;逐步提高毒素浓度能够在一定程度上提高愈伤组织对毒素的抗性。

从江苏省稻瘟病不同优势小种菌株的液体培养液中提取稻瘟病菌粗毒素，以本地区较感病中粳稻新品系Ｌ１１９为材料，研究不同稀释浓度粗毒素对水稻种子萌发、成熟胚愈伤组织诱导及分化的影响；在诱导和分化培养基中分别加入适宜的稻瘟病菌粗毒素进行胁迫培养，以获得抗病性有所增强的变异植株。结果表明，种子萌发后胚芽的长度随着粗毒素浓度的提高而降低，在浓度达到１ ｍ Ｌ／１０ ｍ Ｌ时种子萌发完全受到抑制。种胚愈伤组织的生长随着粗毒素浓度的增加受抑制程度逐渐增强，在浓度为２５％时无愈伤产生；愈伤组织在分化时对粗毒素较敏感，在粗毒素浓度为５％时分化成苗数急剧下降。对诱导、分化２个阶段双重粗毒素胁迫培养的组培再生植株进行．．．