【目的】建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的多重PCR方法。【方法】根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和单核细胞增生李斯特氏杆菌编码溶血素O(LLO)的hlyA基因,分别设计3对特异性引物,对单基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件,如引物浓度、Tm值、模板量等的优化,建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌的稳定的单管多重PCR方法。【结果】针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性...

为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证。结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增。人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定。本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种...

本研究建立一种同时特异性地检测5种常见食源性致病菌的多重PCR方法。根据目前食品中常见病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis、福氏志贺氏菌Shigella flexneri的相关毒力基因,选择具有特异性的副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因、单核细胞增生性李斯特菌编码溶血素O基因、沙门氏菌侵袭蛋白A基因及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因,设计5对特异性引物进行多重PCR...

根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH和副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR设计引物,建立一种快速检测水产品中上述4种常见食源性致病菌的多重PCR方法。结果显示,沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR扩增片段产物大小分别为549、426、348和243 bp,该检测方法具有良好的特异性和灵敏度。设计优化了可用于水产样品中4种目标致病菌的共增菌培养基,该方法应用于35份实际水产样品的检测,并与国标方法对比验证,4种致病菌的整体符合率达94%以上,两种检测方法无显著性差异(P>0.05)。可见,该多重...

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103CFU/mL,单重的灵敏度达到101CFU...

由于食品的多样性和食品基质的复杂性,食品安全问题已成为全社会共同关注的热点问题,其中微生物引起的食源性疾病居全球食品安全问题之首。食源性致病菌的检测是食源性疾病预防与控制的关键环节。平板计数法被评为微生物检测的金标准,但在致病菌检测过程中信号的放大需要通过单个细胞生长成菌落来实现,因此检测周期较长(3—7 d)。此外,现有的准确检测致病菌的技术有聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)等,但由于预处理时间长、操作复杂、检测结果存在假阳性等问题,不适合对致病菌进行现场快速有效的检测。核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段,具有良好的特异性、稳定性、易于修饰和亲和力高等特点,在毒素、抗生素、重金属和致病菌等其他小分子的检测中有很大的潜力。目前,国内外学者已开发了各种基于适配体的检测方法。本文综述了食品中常见的食源性致病菌及其传统的检测方法和近十年来用于致病菌检测的光学和电化学适配传感器,涵盖每种方法的检测策略、检测时间、检测范围和检测限等信息,也提出了适配体传感器在食品安全检测中存在的主要问题,并对其未来研究的发展趋势进行了展望,这些将为今后的研究工作提供一定的基础。

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR...

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的...

[目的]本文旨在解决转录组技术研究食源性致病菌致病机制过程中核糖体RNA(rRNA)无法高效去除的问题。[方法]以9种常见食源性致病菌的201条rRNA序列为参考对象,设计每条rRNA编码基因的反向互补配对DNA探针,随后将探针与细菌总RNA进行杂交,在RNase H和DNaseⅠ的作用下去除rRNA。以大肠杆菌O157:H7 Sakai、单增李斯特菌EGD-e、肠道沙门氏菌CT18以及铜绿假单胞菌PAO1这4株菌的总RNA为模板,分别使用本研究设计的rRNA去除探针以及建立的rRNA去除体系与Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Bacteria)进行rRNA去除,随后用相同方法进行转录组文库构建,并使用Illumina Hi Seq X测序平台进行相同数据量的测序,最后通过生物信息分析比较rRNA去除效果。[结果]共设计rRNA去除探针541条。当总RNA使用量范围为1～5μg,探针使用量为100 pmol,RNase H使用量为2 U,DNaseⅠ保持过量为10 U时,rRNA去除体系的性能达到最优,去除效率达95%以上。使用本研究构建的rRNA去除体系时,4株食源性致病菌残留rRNA平均占总数据量的1.67%,而相同条件下试剂盒残留的rRNA平均占7.61%。此外,本体系对食源性致病菌低表达丰度基因的检出数目是试剂盒的1.90倍。[结论]该体系可以有效去除9种常见食源性致病菌的核糖体RNA,同时也大大降低了试验成本。

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是４种重要的食源性病原弧菌，能够造成人类多种疾病，建立同时检测这４种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉＰｌｅｘ ｅｎＲｉＣｈｍｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ｍｅ－ｑ ＰＣＲ）方法，并含扩增内标用于指示ＰＣＲ反应的假阴性，创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法，为这４种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌１６Ｓ Ｒ Ｒｎａ为扩增内标靶序列设计引物，并针对副溶血弧菌的ＣｏｌｌａｇｅｎａＳｅ、溶藻弧菌的ｇｙＲ Ｂ、霍．．．

对广东省3个不同产区罗非鱼及其养殖环境中食源性致病微生物的构成进行了分析。采用选择性培养基、生物梅里埃微生物鉴定系统与B iolog微生物自动化鉴定系统相结合的方法对罗非鱼和养殖环境中的主要食源性致病菌种类进行分离鉴定。结果表明:罗非鱼鱼体及其养殖环境中存在的主要食源性致病菌种类,随季节的不同而有变化,其中以夏季致病菌种类最多,鱼体及其养殖环境分别为11和12种致病菌;而春季鱼体中致病菌较少,为6种。罗非鱼鱼体及其养殖环境中以致病性嗜水气单胞菌、致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌最为常见,四季均有,其中致病性嗜水气单胞菌以春夏季节检出率较高,环境中检出率达83%~89%,鱼体中达44%~67%;致泻大...

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征的2种致病菌:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清。以载玻片为介质,建立了2种病原菌的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。交叉反应、阻断试验和吸收试验结果均表明本方法特异性强。对人工感染实验中的养殖水体及发病刺参溃烂组织检测,可以检出水体和患病刺参溃烂组织中的相应病原菌,病原菌被染成明亮的黄绿色,检测灵敏度2.4×104cell/mL。冰冻切片检测结果显示,在刺参肿胀嘴部与溃烂肌肉处有大量染成黄绿色的细菌颗粒。结果表明...

以养殖刺参"腐皮综合征"的重要致病菌——灿烂弧菌Vibrio splendidus的16S～23S间隔区序列,设计特异性引物,用PCR方法制备地高辛(DIG)标记探针,建立了原位杂交技术检测感染刺参体内灿烂弧菌的技术方法,并利用该方法对人工感染刺参和健康刺参各组织进行检测。结果显示,感染刺参的体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮、辐水管等组织的原位杂交检测呈阳性,而与健康刺参组织无交叉反应。在感染组织中,阳性信号(显色)强弱清晰,能准确反映出灿烂弧菌的侵染部位及感染程度,这为探明灿烂弧菌的感染途径、感染病程等致病机理研究奠定了基础,也为养殖刺参疾病预防和健康管理提供了技术支撑。

在口岸压载水检测中发现有多种食源性致病菌的存在,给公共卫生和口岸生态环境带来极大风险。目前对食源性致病菌的检测主要是通过细菌的培养及生化鉴定、荧光PCR等方法,但是不能同时检测多种致病菌。本研究针对一种能检测12种食源致病菌的芯片进行了应用研究,用参比菌株和实验室自分离的菌株检测该芯片的特异性,结果表明该芯片的特异性良好,在所检测的菌株之间无交叉反应。在DNA水平上可以检测到110~7 000 copy的DNA分子,在菌裂解液的水平上可以检测到104~105copy数目的菌体,样品添加实验证明1 cfu/m L的菌浓度就可以通过增菌后芯片检测到。该芯片可鉴别金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7、霍乱弧菌、志贺氏痢疾杆菌、空肠弯曲杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、弯曲肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌和产气荚膜杆菌等。研究证明该芯片的灵敏度比PCR水平略低,但是其具备高通量、快速、准确,简单易操作等优点,可以应用于口岸压载水中携带食源致病菌的快速检测。

【目的】由大斑突脐蠕孢(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌(登录号MAT1-1:GU997138和MAT1-2:GU997137)和小斑病菌(登录号MAT1-1:X68399和MAT1-2:X68398)交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp(大病斑菌)与490、136 bp(小病斑菌)的特异性目的条带。25μL多重PCR扩增体系:2×Multiplex PCR Mix 12.5μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃(大病斑菌)和55.0℃(小斑病菌),35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。