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[期刊] 中国农业科学
[作者]
魏霜 汪天杰 龙阳 周广彪 林春贵 黄帅 吴希阳
【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是４种重要的食源性病原弧菌，能够造成人类多种疾病，建立同时检测这４种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉＰｌｅｘ ｅｎＲｉＣｈｍｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ｍｅ－ｑ ＰＣＲ）方法，并含扩增内标用于指示ＰＣＲ反应的假阴性，创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法，为这４种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌１６Ｓ Ｒ Ｒｎａ为扩增内标靶序列设计引物，并针对副溶血弧菌的ＣｏｌｌａｇｅｎａＳｅ、溶藻弧菌的ｇｙＲ Ｂ、霍．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
魏霜 冼钰茵 赵晖 吴希阳
【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR...
关键词：
弧菌 检测 多重PCR
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
程晓艳 刘庆慧 黄倢
本研究建立一种同时特异性地检测5种常见食源性致病菌的多重PCR方法。根据目前食品中常见病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis、福氏志贺氏菌Shigella flexneri的相关毒力基因,选择具有特异性的副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因、单核细胞增生性李斯特菌编码溶血素O基因、沙门氏菌侵袭蛋白A基因及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因,设计5对特异性引物进行多重PCR...
关键词：
多重PCR 食源性病原菌 检测
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈迪 杨银元 李凌飞
为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证。结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增。人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定。本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王慧 朱瑞良 谭燕玲 魏凯 王新建 孙振红 盛鹏程
【目的】建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的多重PCR方法。【方法】根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和单核细胞增生李斯特氏杆菌编码溶血素O(LLO)的hlyA基因,分别设计3对特异性引物,对单基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件,如引物浓度、Tm值、模板量等的优化,建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌的稳定的单管多重PCR方法。【结果】针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性...
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
许拉 黄健 戈蕾 杨冰
通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法。研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测。
关键词：
对虾 PCR 检测 病毒 弧菌
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郑鸣 边传周 王老七
【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李晨 王秀华 黄倢
根据目前水产上常见病原菌鳗弧菌Vibrio anguillarum、嗜水气单胞菌Aeromonas hy-drophila、迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda的毒力相关基因,选择具有特异性的鳗弧菌调控毒力蛋白表达的toxR(Positive transcriptional regulator)基因、嗜水气单胞菌中重要的编码气溶素(Aero-lysin)基因aerA、迟缓爱德华氏菌中编码分泌系统装置蛋白的基因evpA,分别设计1对特异性引物,建立可同时特异性地检测3种菌的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并测试了其特异性和灵敏度。实际样品检测证明,此多重PCR体系具有良好的可靠...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
祝璟琳 王国良 金珊
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌。本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法。经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张晓君 姚东瑞 阎斌伦 秦蕾 毕可然 梁利国
基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
于永翔 王印庚 刘智超 廖梅杰 张正 荣小军 李彬 战文斌
灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
战晓微 郑秋月 傅俊范 徐扬 那晗
为研究食源性金黄色葡萄球菌中MRSA及对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素抗生素的耐药性情况,并建立快速检测鉴定金黄色葡萄球菌耐药性多重PCR方法。对金黄色葡萄球菌进行增菌培养,并提取DNA作为模板,以nuc基因作为菌属鉴定基因,mecA基因作为MRSA检测基因,aac(6')-aph(2'')及aph(3')-Ⅲa基因作为耐氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的检测目的基因,建立四重PCR检测方法并进行特异性及灵敏度评价;利用所建立的方法检测19株金黄色葡萄球菌的分离株。结果表明:对19株金黄色葡萄球菌分离株的PCR检测结果与纸片扩散法的检测结果一致。所建立的多重PCR方法灵敏度高、特异性好,可...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
孙晶晶 高晓建 张晓君 马丽娜 阎斌伦 白雪松 赵佳铭 毕可然 秦蕾
本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的22株病原鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力相关基因的携带情况,并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以PCR方法检测8个毒力相关基因的分布,结果显示,22株病原鳗弧菌均可扩增出6个基因(emp A、vah1、vah4、fla A、rtx A和ton B)目的条带,未扩增出vir A和ang M基因;针对vah4和rtx A设计引物进行双重PCR扩增,同一PCR反应体系可扩增出两条目的条带,灵敏度为2.4×103 CFU/ml,对照菌无任何扩增条带;以vah4设计引物进行LAMP扩增,病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带,呈现阳性反应,6...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
孙晶晶 高晓建 张晓君 马丽娜 阎斌伦 白雪松 赵佳铭 毕可然 秦蕾
本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的２２株病原鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）毒力相关基因的携带情况，并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以ＰＣｒ方法检测８个毒力相关基因的分布，结果显示，２２株病原鳗弧菌均可扩增出６个基因（ｅｍＰａ、Ｖａｈ１、Ｖａｈ４、ｆｌａａ、ｒｔｘａ和ｔｏｎｂ）目的条带，未扩增出Ｖｉｒａ和ａｎｇｍ基因；针对Ｖａｈ４和ｒｔｘａ设计引物进行双重ＰＣｒ扩增，同一ＰＣｒ反应体系可扩增出两条目的条带，灵敏度为２．４×１０３ Ｃｆｕ／ｍｌ，对照菌无任何扩增条带；以Ｖａｈ４设计引物进行ｌａｍＰ扩增，病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带，呈现阳性反应，６株对照菌无阶梯．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
翁思聪 朱军莉 励建荣
根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH和副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR设计引物,建立一种快速检测水产品中上述4种常见食源性致病菌的多重PCR方法。结果显示,沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR扩增片段产物大小分别为549、426、348和243 bp,该检测方法具有良好的特异性和灵敏度。设计优化了可用于水产样品中4种目标致病菌的共增菌培养基,该方法应用于35份实际水产样品的检测,并与国标方法对比验证,4种致病菌的整体符合率达94%以上,两种检测方法无显著性差异(P>0.05)。可见,该多重...
关键词：
食源性致病菌 多重PCR 水产品 检测
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