根据抗草甘膦大豆ＭＯＮ８９７８８分子特征，选择大豆内源参照基因（ＬｅｃｔｉＮ）、玄参花叶病毒启动子（Ｐ－ＦＭＶ ３５Ｓ）、豌豆终止子（ｔ－ｅ９３＇）和目的基因（ｃＰ４－ｅＰＳＰＳ）４个基因作为复合ＰｃＲ检测基因，其特异性引物序列参照国家相关标准，对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。最终建立了可同时检测除内源基因在外的３种外源基因复合ＰｃＲ检测体系。

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNASYBRGreenI结合染料实时荧光定量PCR技术,扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因,绘制2种基因扩增的循环数拷贝数标准曲线图,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量;并作重现性和熔解曲线分析。结果表明,lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好,R2值分别达到0.9997和0.9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示,实测值与实际值接近,相对偏差5%～11%。SYBRGreenI实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。

【目的】抗逆大豆IND-??41?-5已获得中国进口加工原料安全证书，建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR）检测方法，为抗逆大豆IND-??41?-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-??41?-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针，结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针，随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选，遴选出1对候选引物探针；设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度，优化qPCR方法的反应体系；设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性；以纯合抗逆大豆IND-??41?-5基因组DNA作为标准样品，梯度稀释成标准溶液模板，绘制标准曲线，考察qPCR方法的线性动态范围，配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品，评价定量方法的准确性；配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品，测试方法的检出限；拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试，确定方法的定量限；最终确定抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法的关键技术参数。8家有资质单位对该定量PCR方法的特异性、检出限、定量限、准确性等进行验证，采用柯克伦法和格拉布斯法评估qPCR方法的重复性和再现性，利用线性最小二乘法对准确性样品测试结果的测量不确定度进行预评定。【结果】通过特异性筛查确定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探针为候选组合，建立了抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性qPCR方法，扩增片段为138 bp，优化的反应体系引物终浓度为0.4μmol·L~(-1)、探针终浓度为0.2μmol·L~(-1);IND-??41?-5和Lectin标准曲线的线性动力学范围为33—83 190 copies的基因组DNA，该方法可准确定量5%、1%和0.1%含量的IND-??41?-5测试样品，偏差和相对标准偏差（RSD）均小于25%；确定检出限为0.05%、定量限为0.1%。8家实验室间联合验证该方法稳定性好、特异性强，检出限为0.05%，定量限为0.1%，且具备良好的实验室间重复性和再现性，经测量不确定度预评定后，获得5份抗逆大豆IND-??41?-5测试样品的测量结果分别为（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%，结果准确可靠。【结论】成功建立了抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法，能够实现抗逆大豆IND-??41?-5转化体成分的精准定量检测。

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。

【目的】大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）是微生物肥料重要的功能菌种之一，可通过生物固氮为大豆生长提供氮素，实现节本增效，菌株5873作为其典型代表，已广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异引物，建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速检测方法，对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要。【方法】以商业化菌株大豆根瘤菌5873为供试材料，基于其全基因组序列和NCBI数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列，以及与其高度同源（基因组ANI值大于99.95%）的大豆根瘤菌USDA 6T差异片段，通过多重序列比对，进行特异引物设计和筛选，获得特异性引物对，并通过对PCR反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测，建立大豆根瘤菌5873的快速检测方法。然后，采用盆栽试验，将大豆根瘤菌5873与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际，应用上述方法对大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力进行评价和方法验证。【结果】筛选获得了一组特异引物4-4和Q1(4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′)，优化并建立了PCR快速检测方法，即反应体系：Premix Taq~(TM) 12.5μL，引物各1.0μL，基因组DNA 15 ng左右，加ddH2O补足至25μL；反应条件：95℃预热5 min,94℃变性45 s,61℃退火45 s,72℃延伸60 s,30个循环，再72℃延伸10 min。通过凝胶电泳检测目的条带的有无（355和218 bp），即可实现大豆根瘤菌5873的快速检测，该方法检出灵敏度为1 850 CFU/μL。此外，借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力，与传统BOX-PCR评价结果一致。【结论】大豆根瘤菌5873快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板，直接进行PCR扩增的鉴定操作，省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA提取及测序鉴定等繁琐的环节，大大减少了工作量，只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌5873，为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考。

为实现转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’转化体成分的精准定量检测,以转基因大豆‘ZH 10-6’的5′端边界序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针浓度进行优化,经特异性测试,建立了耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’的微滴式数字PCR检测方法。结果表明:1)特异性良好:只有以转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’基因组为模板才有扩增信号;2)灵敏度高:在相对标准偏差≤25%的情况下,方法的检出限(LOD)为13.0个拷贝;定量限(LOQ)为66.0个拷贝;3)PCR扩增反应模板含量与样品拷贝数之间线性相关系数R2>0.99,DNA含量线性范围为0.08%～100.00%。综上,本研究建立的转基因耐除草剂大豆‘ZH 10-6’转化体定量方法特异性强、稳定性好、准确度和灵敏度高,可用于对转基因大豆品种‘ZH 10-6’的定量检测。

【目的】通过分析不同生长期喷施草甘膦后,抗草甘膦转基因大豆生长和产量构成的变化,阐明一定浓度的草甘膦对转基因大豆生长繁育的影响,并对转基因大豆田间实际除草过程中草甘膦喷施时间及浓度的合理选择提供数据支持及理论研究依据。【方法】选择抗草甘膦转基因大豆GTS-40-3-2,采用田间随机区组的设计方法,在大豆生长的V1—V5期茎叶喷施一定浓度梯度的41%草甘膦异丙胺盐水剂,研究草甘膦对不同时期转基因大豆生长及产量构成的影响,并同期监测该浓度梯度草甘膦的实际除草效果。【结果】1.23—12.30 kg.ai.hm-2的草甘膦均能有效控制杂草,但喷施草甘膦超过推荐剂量1.23—2.46 kg.ai.hm...

【目的】评价美国孟山都公司生产的抗草甘膦转基因大豆40-3-2作为加工原料引入中国可能带来的演化为杂草的生态风险,验证转基因大豆杂草化环境安全评价条款的可操作性。【方法】在农田生态环境下比较了抗性大豆、受体品种和当地常规品种的生存竞争能力、繁育能力、自生苗、种子落粒性和延续能力。【结果】在适宜季节种植的转基因大豆的生存竞争能力和繁育能力明显低于当地常规品种,表现在复叶数少、植株较矮、结实率低;受体品种的生存竞争能力和常规品种相似,但繁育能力低于常规品种。在非适宜季节三者的生存竞争能力相似,而受体品种和抗性大豆的结实能力都比常规品种略强。3个品种的落粒性都不强,形成自生苗的可能性也都很小。所有供...

为建立5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPs)蛋白的石英晶体微天平(QCM)传感检测方法,采用在金片表面修饰抗原所对应的单克隆抗体的方法,利用QCM技术,对CP4-EPSPs蛋白进行检测研究。结果表明:该方法灵敏度达到500ng·mL-1,特异性好,重复性高,检测转基因玉米含量检出限为0.1%。该方法不足之处在于检测仪器不方便携带,在未来研究中考虑研发便携式QCM检测装置。

[目的] 本文建立了不衍生直接通过液相色谱质谱联用检测水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法，并对传统柱前衍生液相色谱质谱联用检测水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法进行了优化，进而对2种方法进行系统比较。[方法]直接进样法：样品过0.22 μm水系滤膜后直接进样检测，以乙腈和16 mmol·L~(-1)氨水为流动相，HSS T3色谱柱梯度洗脱，负离子源模式，HPLC-MS/MS检测；柱前衍生法：样品经过9-芴基甲基三氯甲烷（FMOC-Cl）柱前衍生后过0.22 μm水系滤膜，以乙腈和1%甲酸+10 mmol·L~(-1)乙酸铵为流动相，BEH C_(18)色谱柱梯度洗脱，正离子源模式，HPLC-MS/MS检测。[结果]直接进样法：草甘膦和氨甲基膦酸在0.5～200 μg·L~(-1)内线性关系良好，检出限（以3倍信噪比计）分别为0.104 μg·L~(-1)和0.072 μg·L~(-1)，定量限（以10倍信噪比计）分别为0.348 μg·L~(-1)和0.241 μg·L~(-1)，空白水样2种物质5个浓度水平的添加回收率为81.98%～111.24%，相对标准偏差（RSD）为2.18%～16.52%；柱前衍生法：草甘膦和氨甲基膦酸在0.5～200 μg·L~(-1)内线性关系良好，检出限（以3倍信噪比计）分别为为0.019 μg·L~(-1)和0.024 μg·L~(-1)，定量限（以10倍信噪比计）分别为0.063 μg·L~(-1)和0.078 μg·L~(-1)，空白水样2种物质5个浓度水平的添加回收率为85.56%～110.32%，相对标准偏差（RSD）为0.44%～8.44%。[结论]柱前衍生法和直接进样法都能满足水中草甘膦和氨甲基膦酸的检测要求，前者具有更好的灵敏度，但是需要复杂的衍生步骤，且衍生时间需4 h以上；而直接进样法省去衍生步骤，易于操作，方便快捷。

【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R,建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性,引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242bp的特异片段,在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增,检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50pg·μl-1,而...

[目的]本文旨在探究抗除草剂转基因大豆与野大豆基因流动后可能产生的生态风险。[方法]以抗草甘膦转基因大豆TS(父本)和内蒙古包头野大豆WS(母本)人工杂交F_1的自交种F_2为对象，研究F_2在农田土和荒地土2种土壤以及无杂草竞争和有杂草竞争2种种植条件下的适合度；并观察不同硬实率的F_2自交种子的种皮结构。[结果]F_2的出苗率为75.00%,显著高于WS,但低于TS。对于单株结荚数、单株饱粒数，4种种植方式下，F_2均显著低于WS;除在混种荒地土下F_2低于TS外，其他条件均高于TS或与TS相当。F_2的株高、百粒重以及地上部干生物量均显著高于WS,但低于TS。F_2自交种子出现种皮色和硬实率的明显分化，且种脐的开放程度及种皮表面是否有凹陷小孔是影响硬实率的关键因素。[结论]F_2均能完成生活史，且产生饱满种子，说明转基因大豆的花粉漂移到野大豆并产生杂交后代，杂交后代在自然环境中有生存定植的可能性。

【目的】为探明干旱胁迫(5d)及旱后复水条件下不同草甘膦剂量对抗草甘膦大豆(RR1)幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响。【方法】采用盆栽试验,在大豆的第三复叶期进行水分胁迫和草甘膦处理。【结果】(1)正常水分条件下,草甘膦增加了RR1的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性,以及丙二醛(MDA)含量和相对电导率(EL),且随剂量的增加和处理5d内时间的延长而升高;草甘膦处理17d后,各指标均有所下降。(2)干旱条件下,较低剂量的草甘膦处理使RR1的SOD、POD、CAT活性随胁迫时间的延长而升高,>0.92kg·hm-2处理的各保护酶活性随胁迫时间的延长呈先...

【目的】转GAT和EPSPS双价基因抗草甘膦大豆‘GE-J16’是我国具有自主知识产权的抗除草剂材料,喷施草甘膦后,评价草甘膦对杂草防除、大豆安全和杂草发生的影响,为其将来商业化种植后的安全监测与杂草治理提供数据支持。【方法】除草效果:每小区以对角线5点取样法取5个0.25 m2样点并标记,施药后28 d调查禾本科和阔叶杂草株数,并剪取地上部分称取鲜重,计算株防效和鲜重防效。对大豆安全性:每小区以对角线5点取样法,每点随机取4株大豆并标记,在喷药当天、药后7、14、21及28 d调查大豆株高和复叶数,观察药害,收获前每小区取50株大豆调查结荚数及产量。杂草发生情况:每小区以对角线5点取样法取5个0.25 m2样点并标记(避开除草效果取样点),调查并记录每种杂草种类、株数,计算每种杂草相对多度。【结果】转基因大豆喷施900、1 800和3 600 g a.i./hm2草甘膦对禾本科杂草株防效2016年分别为84.30%、95.22%和83.62%,阔叶杂草株防效分别为49.80%、64.52%和61.93%,禾本科和阔叶杂草鲜重防效分别在95.36%和82.05%以上,2017年对禾本科和阔叶草株防效分别达94.93%和85.09%以上,对禾本科和阔叶杂草鲜重防效分别达98.00%和96.57%以上。转基因大豆喷施草甘膦对大豆生长没有不良影响,产量高于人工除草处理。两年研究结果表明转基因抗除草剂大豆喷施草甘膦后杂草群落发生改变,转基因抗除草剂大豆田不除草处理小区主要优势阔叶杂草为反枝苋(Amaranthus retroflexus)、打碗花(Calystegia hederacea)、马齿苋(Portulaca oleracea),禾本科杂草为狗尾草(Setaria viridis)、马唐(Digitaria sanguinalis)和牛筋草(Eleusine indica),共6种,喷施草甘膦900—3 600 g a.i./hm2后转基因大豆田5种主要优势杂草为打碗花、夏至草(Lagopsis supina)、马齿苋、牛筋草和狗尾草。【结论】转基因抗草甘膦大豆‘GE-J16’喷施草甘膦900—3 600 g a.i./hm2对杂草有很好的防除效果,对大豆安全。因此,转基因抗草甘膦大豆‘GE-J16’将在我国有很好的商业化应用前景,喷施草甘膦影响杂草种群的发生,如今后商业化种植需长期密切监测种群变化。

【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15mi...