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[期刊] 水产学报
[作者]
郜婷 吴斯宇 高彩霞 夏苏东 尹纪元 王英英 李莹莹 石存斌 王庆
为研究II型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）病毒样颗粒（VLPs）疫苗，实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统（BEVS）将具有免疫原性的GCRV-VP3/VP4/VP35蛋白进行GCRV-VLPs的组装。试验将编码VP35蛋白的GCRV-s11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTA~(TM)，然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞，筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度，并通过间接免疫荧光（IFA）和蛋白质印迹法（Western blot）鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示，实验获得了较高滴度的重组杆状病毒，并且重组蛋白在杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达蛋白的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染Sf9细胞组装GCRV-VLPs，通过透射电镜（EM）观察VLPs的组装情况。结果显示，GCRV-II的3个蛋白在Sf9昆虫细胞中可以完成自我组装，形成与天然病毒结构形似的VLPs，直径大小为65-72 nm。本实验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘永奎 王庆 曾伟伟 石存斌 张超 陈道印 吴淑勤
收集江西南昌地区患典型草鱼出血病的病鱼组织,进行超薄切片电镜观察,结果显示,在脾、肾样品中发现大量病毒颗粒,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)相似。取病鱼肌肉、内脏研磨,组织液经离心、过滤除菌后进行鱼体人工感染试验和细胞感染实验,结果发现,人工感染试验鱼出现死亡,且具有典型出血症状;组织滤液感染草鱼肾细胞系(CIK)细胞后,盲传6代未观察到典型细胞病变效应,但感染细胞固定后经超薄切片电镜观察,细胞质内有大量病毒存在,与病鱼组织切片观察到的病毒形态一致。SDS-PAGE结果进一步揭示,新分离病毒株(暂命名JX-0...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张超 王庆 石存斌 曾伟伟 刘永奎 江海明 吴淑勤
从浙江省湖州地区采集发病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)样本中,取症状明显病料的肝、脾、肾组织,经过滤除菌处理后接种草鱼肾脏细胞(CIK)。盲传8代,CIK细胞未出现明显细胞病变,但感染细胞固定后经电镜观察发现,细胞质内有大量病毒聚集,病毒无囊膜,近球形,直径约70nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)相似。将病毒提纯后分别经DNA酶、RNA酶和绿豆核酸酶消化,证实为双链RNA(dsRNA)病毒。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,病毒基因组由11个dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特...
关键词：
草鱼呼肠孤病毒 病毒分离 病毒鉴定
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
郝贵杰 沈锦玉 潘晓艺 徐洋 姚嘉赟 尹文林
2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8~10 cm的草鱼鱼种。5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡。将无菌处理的病样滤液接种草鱼肾细胞(CIK),连续接5代均出现明显的细胞病变(CPE),并与草鱼呼肠孤病毒参考株所产生的CPE一致。该株病毒的TCID50为10-8/0.1ml。内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察,发现组织内有大量的病毒颗粒,大小均一,近似球形,直径约70~75 nm。理化鉴定表明,氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化,说明该株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗...
[期刊] 水产学报
[作者]
高彩霞 曾伟伟 汤亚方 王英英 王庆 周文礼 吴杰兴 刘世旭 尹纪元 李莹莹
为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同分离株毒力强弱及生物学特性的差异,该研究从患病和健康草鱼体内分离到Ⅱ型GCRV各一株,分别命名为ZH180804和CQ180701,并从细胞培养特性、致病性、基因组带型、基因序列差异、遗传进化关系等方面进行比较分析。结果显示,ZH180804对草鱼和稀有鲫的致死率分别为80%和100%, CQ180701对草鱼和稀有鲫的致死率分别为0和10%,初步表明ZH180804为强毒株,CQ180701为弱毒株,且弱毒株感染过的草鱼对强毒株的攻击感染具有较好的免疫保护;2株分离株在草鱼鳔细胞(GSB)、稀有鲫卵细胞(GRE)及稀有鲫尾鳍细胞(GRF)中均能增殖但不产生致细胞病变效应(CPE),且ZH180804株的增殖量是CQ180701株的1 000倍以上;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,2株分离株基因组带型相似,但S7、S8、S9、S10与S11节段的分布存在一定的差异;2株病毒的S7与S11节段的基因序列同源性分别为98%和99%。基于S7与S11节段编码的氨基酸序列构建的遗传进化树显示,2株分离株聚在同一个分支上,具有较近的亲缘关系。研究表明,从患病和健康的草鱼中分离的2株Ⅱ型GCRV有较多共性,但其复制能力、致病性等方面存在较大差异。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
徐洋 郝贵杰 沈锦玉 郑善坚 潘晓艺 姚嘉赟 尹文林
对从江西省南昌县莲塘镇的患病草鱼鱼种池塘采集到草鱼出血病疑似病样材料分离出的两株病毒株进行了鉴定。结果显示:用除菌过滤后的患病鱼肝脏、脾脏、肾脏组织浆滤液腹腔注射感染8～10 cm健康草鱼鱼种,5 d后试验鱼发病,可复制出自然发病症状,死亡率达50%以上,对照组未有死亡。用病样滤液接种草鱼肾细胞系(CIK),可产生细胞病变效应(CPE),病毒的TCID50分别为10-8.3/0.1 mL和10-8.0/0.1 mL。理化特性研究结果显示:氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比变化不显著。病毒基因组RT-PCR反应可扩增出目的片段,序列测定与分析结果表明,其与GenBank中GCRV(登录号为...
[期刊] 水产学报
[作者]
李贤 曾伟伟 王庆 王英英 李莹莹 宋新建 黄琦雯 石存斌 吴淑勤
草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型（ＧＣＲＶⅡ）是当前导致草鱼出血病流行和暴发的主要基因型，本研究拟通过分析ＧＣＲＶⅡ代表株ＨＺ０８在不同鱼类细胞中的增殖情况来筛选ＧＣＲＶⅡ的敏感细胞系。首先以不同浓度的ＨＺ０８株接种草鱼吻端成纤维细胞（ＰＳＦ）和草鱼鳔细胞（ＧＳＢ），以确定病毒接种的最佳浓度；然后以最佳接种浓度同时感染ＰＳＦ、ＧＳＢ、草鱼肝细胞（Ｌ８８２４）、草鱼卵巢细胞（ＣＯ）等１０种鱼类细胞，接毒后每天观察细胞状态，用荧光定量ＰＣＲ（ｑ ＰＣＲ）方法定量分析ＨＺ０８在各种细胞系中的增殖量，并在感染５ ｄ后用间接免疫荧光定性分析病毒在各种细胞中的增殖情况。结果显示，ＨＺ０８感染细胞的最佳接种浓度为１．０×．．．
[期刊] 淡水渔业
[作者]
曾伟伟 王英英 尹纪元 汤亚方 李莹莹 王庆 高彩霞 任燕 刘春 石存斌
为了解决Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus genotypeⅡ,GCRV-Ⅱ)含量和滴度测定方法的选择问题,本研究利用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)和间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay,IFA)三种方法来对GCRV-Ⅱ进行检测和含量测定,从特异性、敏感性、可靠性和检测结果的相关性来比较这三种方法对于GCRV-Ⅱ定量检测的差异。结果显示:qPCR、IPMA和IFA三种方法检测GCRV-Ⅱ的最低限分别为8.6、86和86拷贝/μL,qPCR的检测灵敏度比IPMA和IFA高一个数量级;特异性分析表明,qPCR、IPMA和IFA三种方法均只能检测出GCRV-Ⅱ型分离株,而其它病毒和未感染病毒的阴性对照细胞均为检测阴性,表明这三种方法均具有较高的特异性;3种方法分别检测60份已知临床样品,qPCR、IPMA和IFA的诊断敏感性和特异性分别为96.7%(29/30)和100%(30/30)、100%(30/30)和93.3%(28/30)及100%(30/30)和100%(30/30);三种方法对于GCRV-Ⅱ的定量检测结果中病毒拷贝数和病毒滴度之间具有较好的相关性,其拟合曲线分别为:Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=23.629X-536 174(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.996)、Y(IFA,TCID_(50)/mL)=20.318X-575 062(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.995)和Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=1.161X-1 176(IFA,TCID_(50)/mL)(R~2=0.999)。结果表明,GCRV-Ⅱ病毒滴度的测定,除了用IPMA和IFA外,也可以采用qPCR方法通过测定病毒的核酸拷贝数来测算其病毒滴度。
[期刊] 水产学报
[作者]
姜霖 涂加钢 张永安
Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用，本研究扩增S11基因并插入载体pCMV-3×flag中，构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒，转染草鱼肾细胞（CIK）后感染Ⅱ型GCRV，收集感染后的上清液与细胞。首先利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中Ⅱ型GCRV-S6基因的mRNA，结果显示，过表达VP35在病毒mRNA水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；然后扩增S6基因并插入到载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达质粒，纯化Ⅱ型GCRV-VP4蛋白并制备多克隆抗体，用Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白，结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；最后使用pET-32a-S6质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线，建立Ⅱ型GCRV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒，结果表明过表达VP35增加Ⅱ型GCRV病毒拷贝数。本研究从三个维度证明过表达VP35蛋白促进Ⅱ型GCRV增殖，有助于深入解析VP35蛋白功能，也为进一步探究Ⅱ型GCRV的致病机制提供理论基础。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 李艳秋 肖艺 曾令兵
以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pC...
[期刊] 水产学报
[作者]
秦波 程洛单 陈杰 蒋霞云 邹曙明
为探索草鱼出血病防治新技术,实验采用衣壳蛋白靶向灭活(capsid-targeted viral inactivation,CTVI)策略,利用Tgf2转座子元件,构建了带爪蟾EF1α或鲤热休克蛋白70两种不同启动子的CTVI转基因质粒p Tgf2-EF1α-VP3-SN或p Tgf2-Hsp70-VP3-SN。该2种质粒均包含GCRV衣壳蛋白VP3与金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus aureus nuclease,SN)融合表达阅读框。通过将2种CTVI转基因质粒与体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA共同显微注射入草鱼1~2细胞期受精卵,获得了带2种不同启动子的CTVI...
[期刊] 水产学报
[作者]
徐诗英 刘林 李婧慧 邹勇 倪金俤 杨鸢劼 贡成良 曹广力 薛仁宇 陈辉
将草鱼呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71-VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果。重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30μg空载体组及对照组。于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果。结果显示,pFastBac-β-VP71-VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
范玉顶 马杰 周勇 江南 刘文枝 曾令兵
根据Gen Bank登录的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同基因型毒株编码VP2蛋白的S2节段保守序列,设计1对简并引物,通过优化反应条件及灵敏度和特异性评价,建立了一种能同时检测三种基因型GCRV的通用RT-PCR检测方法。结果显示:该方法在三种基因型GCRV中均扩增出大小约590 bp的特异性条带;灵敏度试验结果显示,该方法对于I、Ⅱ、Ⅲ型GCRV的检测限分别为380、250和380拷贝/μL。该方法可特异性地检测目前已知的三种基因型GCRV,而在大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)中无扩增产物。利用该方法检测49份草鱼出血病疑似样品,结果显示均为GCRV阳性,其中I型阳性率为8. 2%,Ⅱ型阳性率为85. 7%,Ⅲ型阳性率为2%,I、Ⅱ型混合感染阳性率为4. 1%,其他类型的混合感染未检测到。结果表明,本研究建立的针对I、Ⅱ和Ⅲ型GCRV的RT-PCR检测方法具有通用性好、省时高效的突出特点,同时还兼具较高的灵敏度和特异性。
[期刊] 水产学报
[作者]
殷亮 王庆 曾伟伟 李永刚 王英英 刘春 梁红茹 石存斌 吴淑勤
为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普...
[期刊] 水产学报
[作者]
郝贵杰 潘晓艺 姚嘉赟 徐洋 尹文林 沈锦玉
将编码草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)主要衣壳蛋白VP70.9kb的基因片段连接至克隆载体pMD19-T中,筛选阳性克隆并测序,经检测为正确序列后,再将目的片段克隆入真核表达载体pCI,筛选得到阳性重组质粒pCI-VP7。然后构建pCI-VP-GFP重组表达质粒(即GFP基因与VP7的一段上游基因融合表达),用PCR及酶切方法鉴定克隆的正确性。并用脂质体法将其转染入真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及RT-PCR特异性检测。结果表明,GFP基因与VP7的一段上游基因被成功转染到COS-1和CIK细胞,并得到了很好的表达。进而证明pCI-VP...
关键词：
草鱼呼肠孤病毒 衣壳蛋白 转染 真核表达
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