【目的】大蒜黑腐病菌（ＥｍｂＥｌｌｉｓｉａ ａｌｌｉｉ（ＣａｍｐａｎｉｌＥ）ｓｉｍｍｏｎｓ）的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长，而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似，极难分辨，需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量ｐＣＲ（ＲＥａｌ－ｔｉｍＥ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖＥ ｐＣＲ，ｑ ｐＣＲ）体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从ｎＣｂｉ的ＧＥｎ ｂａｎｋ数据库中，选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的３－磷酸甘油脱氢酶（Ｇｐｄ）基因核酸序列数据１５种，应用引物设计软件ｐＲｉｍＥＲ ＥｘｐＲＥｓｓ，根据探针设计原则从理论上选出１条探针和３对．．．

【目的】大蒜黑腐病菌(Embellisia allii(Campanile)Simmons)的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的Gen Bank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶(gpd)基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对...

【目的】建立荧光定量PCR体系以准确灵敏的鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)【方法】根据筛选的TCK独有差异基因片段(1322bp)设计特异性引物对CQUTCK4/CQUTCK5和TaqMan探针CQUP1,建立SYBRGreenⅠ荧光染料法和TaqMan水解探针法定量PCR检测体系,并对体系进行优化。【结果】建立的两套定量PCR检测体系的检测下限相当,可达到0.1fg,对应的拷贝数为2.31×104个,检测灵敏度比常规PCR高2～3个数量级,均可成功鉴别出TCK与小麦网腥黑穗病菌(Tilletiacaries(DC)Tul,TCT),并可快速准确检测...

以巨菌草(Pennisetum giganteum)的叶片、茎、根为试验材料，通过分析8个基因18s rRNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、CYP、TUB在正常生长、干旱以及盐碱胁迫下荧光定量PCR中稳定性表达情况，筛选巨菌草的稳定内参基因。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件计算内参基因的表达稳定值并进行排序，最终通过赋值法综合排序确定稳定内参基因。结果表明，内参基因的稳定性在不同处理下存在差异。其中，ACTB稳定性好，为本研究筛选出巨菌草的内参基因。本研究筛选出的内参基因，为后续巨菌草功能基因表达分析奠定了基础。

为准确、快速、便捷检测出土壤中根肿病菌休眠孢子量,应用所建立的根肿病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测技术,测定了湖南湘潭县响水乡、长沙县路口镇、桃江县桃花江镇十字花科作物根肿病发生地的42份土样的休眠孢子数量。检测结果表明,40份土样的根肿病菌休眠孢子量为(2.76×104~4.37×106)个/g;休眠孢子量≥104个/g的土壤均有根肿病发生,而休眠孢子量为8.42×102、9.78×102个/g的2份土样未发生根肿病,说明当土壤中根肿病菌休眠孢子量≥104个/g时,根肿病害易发生。

由茶麋子葡萄座腔菌Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ引起的山核桃Ｃａｒｙａ Ｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ干腐病是山核桃栽培过程中的主要病害，该病菌表现明显的＂潜伏侵染＂特性。研究山核桃树体中干腐病菌的定量检测技术对山核桃干腐病的预测预报及科学防治具有重要的指导意义。根据茶麋子葡萄座腔菌的ｅＦ１α基因设计特异性引物，通过普通聚合酶链式反应（ｐＣｒ）和实时荧光定量ｐＣｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐＣｒ）扩增发现引物ｅＦｒｔ－Ｆ１／ｒ１对山核桃干腐病病菌的特异性及扩增效率较高，可稳定扩增出２３０ Ｂｐ的目标条带。应用此特异性引物建立的实时荧光定量ｐＣｒ干腐病病菌检测方法能够定量检测出山核桃植株样品．．．

【目的】利用定量ＰＣＲ和表达分析软件研究候选内参基因在光皮桦不同组织中的表达稳定性，并通过目的基因的表达分析验证其可靠性，以获得可用于光皮桦定量ＰＣＲ的稳定内参基因。【方法】选取１６个常用的看家基因作为候选内参基因，设计引物，通过普通ＰＣＲ、溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性；通过实时荧光定量ＰＣＲ及软件ｇｅ ＮｏＲｍ、ＮｏＲｍ ＦｉＮｄｅＲ和Ｂｅｓｔ ＫｅｅＰｅＲ分析候选内参基因在光皮桦１６个不同组织中的表达稳定性，根据分析结果筛选出最佳的内参基因和组合，并进一步通过２个目的基因ＣｓＬｄ和ＫｏＲ对内参基因的稳定性进行验证。【结果】ＰＣＲ和电泳结果显示，候选内参基因ＰＣＲ目的片段条带清晰．．．

根据GenBank上猪GAPDH基因的序列设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了Real-time PCR方法。以阳性重组质粒为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点。研究结果为GAPDH作为内参基因用于猪相关基因定量表达分析奠定了基础。

【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica)。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度...

设计了“实时荧光定量PCR分析IPTG诱导EGFP基因在大肠杆菌中的异源表达”实验,研究IPTG诱导浓度和温度对EGFP基因表达的影响。结果表明,IPTG浓度为270μmol/L、诱导温度为16℃、诱导时间为18 h的条件下,EGFP mRNA的表达量最大。通过该实验的学习,使学生掌握实时荧光定量PCR的相关实验原理、技术以及实时荧光定量PCR仪的使用,培养学生的科研能力和综合素质。

实时荧光定量PCR(Reverse transcription quantitative real-time PCR， qRT-PCR)技术常用于基因表达分析，但其结果的准确性有赖于筛选出稳定表达的内参基因从而对数据进行均一化。为筛选出铅（Pb）胁迫下不同浓度褪黑素处理狗牙根根尖组织稳定表达的内参基因，本研究在前期生理试验基础上，对选用的8个候选内参基因(PP2A、TIP41、CACS、ACT、EF-1α、TUB、UPL7、GAPDH)在6个样本中的表达量进行qRT-PCR分析。结果发现，8个内参基因在不同样本中表达水平存在较大差异，且单个内参基因Ct值在不同样本中变化范围有显著差异。利用ΔCt 算法、NormFinder、BestKeeper和GeNorm程序对内参基因稳定性进行排序，并结合线上工具RefFinder计算得出各内参基因稳定性的综合排名。结果表明，CACS + PP2A为不同浓度褪黑素处理铅胁迫下狗牙根根尖组织最适内参基因组合。该内参基因组合将为解析褪黑素影响狗牙根Pb耐受性和吸收转运的分子机制奠定基础，进一步推动褪黑素在植物修复Pb污染土壤中的实际应用。

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的SYBR Green I实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌(R.solani)、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌(Gaeum...

【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据。【方法】依据GenBank中葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计1对特异性引物(F-cox-Pv/R-Pv),建立并优化常规PCR和real-time PCR反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、葡萄白粉病菌(Uncinula necator)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、葡萄溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、辣椒炭疽病菌(C.capsica)、甘草根腐病菌(Fusarium solani)、西葫芦白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)、番茄菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、马铃薯干腐病菌(F.equiseti)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)等14种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价。运用已构建的real-time PCR体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,利用SPSS 19.0软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系。【结果】研究设计的引物特异性高,常规PCR仅对葡萄霜霉病菌DNA有扩增条带,为139 bp;real-time PCR检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰。常规PCR检测的灵敏度为10 pg·μL~(-1),real-time PCR的灵敏度可达到0.1 pg·μL~(-1),是常规PCR检测灵敏度的100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR循环阈值(Ct)与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R~2=0.997,扩增效率为98.50%,线性范围达7个数量级,在2.4×10~3—2.4×10~9 copies/μL呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行real-time PCR检测,结果表明叶片内病原菌潜伏侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长,y=6.34×10~4·e~(0.084x),相关系数R~2=0.936。该real-time PCR检测体系在接种6 h后就可以检测到葡萄霜霉病菌DNA,检测量为5.68×10~4 copies/μL病原菌DNA。【结论】构建的葡萄霜霉病菌real-time PCR检测体系的灵敏度远高于常规PCR,且特异性强、重复性好,其Ct值与模板浓度呈较好的线性关系,扩增效率高,可用于定量检测葡萄霜霉病菌的潜伏侵染量。

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一，早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂，而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测，研究旨在建立小麦纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅＲｅａｌｉｓ）的ｓＹＢＲ ＧＲｅｅｎ ｉ实时荧光定量ＰｃＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰｃＲ）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β－ｔｕＢｉｌｉｎ序列，设计１对特异性引物，建立并优化ｓＹＢＲ ＧＲｅｅｎ ｉ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰｃＲ反应体系，利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（Ｒ．ｓｏｌａｎｉ）、双核丝核菌ａＧ－ａ和ａＧ－Ｆ菌株、小麦全蚀病菌（Ｇａｅｕｍ．．．

提取了分别来自11个种共13株真菌(都是大豆上的常见病害的病原菌)的DNA.采用ITS序列扩增通用引物对其进行PCR扩增,并对大豆茎褐腐病菌的PCR产物进行测序.根据所得大豆茎褐腐病菌与其常见易混淆品所在属在ITS区的基因序列比较分析,设计并合成了1对特异性引物.采用此对引物,只有大豆茎褐腐病菌能扩增出500 bp条带,检测的灵敏度达到4.2 pg/μL.将此对引物应用于人工接种大豆茎褐腐病菌大豆的检测,结果表明,此方法能够成功区分大豆茎褐腐病菌及其近似种.